2.聚合酶链式反应技术
时间:2025-07-10
时间:2025-07-10
一、实验目的
通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验 技术。
二、实验原理聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR) :是体外酶促合成DNA 片段的一种技术。利用PCR技术可在数小时 之内大量扩增目的基因或DNA片段,以用 于基因工程操作。
PCR的原理:用于扩增位于两段已知序列之间的DNA片段,
类似于天然DNA的复制过程。以拟扩增的DNA分子为模板,用一对与待扩增 的靶DNA区段两端序列互补的人工合成的寡核苷酸 片段为引物,在DNA聚合酶的作用下,按照半保留 复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的 DNA合成, 重复这一过程,即可使目的DNA片段得到扩增。
基本反应步骤分三步: 1. 变性 (Denaturation): 加热使模板DNA在高温下变性,双链间 的氢键断裂而形成两条单链。 2. 退火 (复性) (Annealling):
使溶液温度降至50-60℃,模板DNA与 引物按碱基配对原则互补结合。
3. 延伸 (Extension):溶液反应温度升至72 ℃ ,以单链DNA为模板, 在DNA聚合酶的作用下、利用4种 dNTPs 等,从引物 的 3′ 端开始,结合单核苷酸,按5 ′ 向形成与模板链互补的新DNA链。 上述 3 步为一个循环,每经过一个循环,样 本中的DNA量应该增加一倍,新形成的链又可成为新 一轮循环的模板,经过25~40个循环后DNA可扩增 106 ~ 109 倍。 3 ′方
早期的PCR技术94℃
55℃
72℃
PCR循环
费事、费力、易出错
PCR的自动化-----快速、简便
PCR基因扩增仪
三、试剂、材料和仪器(1)材料: E.coli DH5 alpha( pGADT7-x ) X来源于P5,300bp 引物序列: At-F:CCGCTCGAG ATGGCAAACTTATTCTT At-R:GAAGATCT TCATTCTAGAACACCTTG (2)仪器 PCR仪 制冰机 微型离心机 移液器
(3)试剂 模板DNA:1-5ng/ml 5u/μl
Taq DNA聚合酶: 0.5 ~ 5 U / 100 μl MgCl2:1.5 ~ 2.0 mM ~ 1 μM
10XPCR缓冲液( Tris- Cl,KCl,BSA) dNTPs :0.02 ~ 0.2 mM
25mM 2mM
10pmol/μL引物(Primer):0.2
水(无菌纯水):补足整个反应体积。
四、实验步骤模板 2 L 1. 反应混合液的配制 10 L 3 L 1.5 L 10 L 1.5 L 0.5 L 5 L 0.5 L 20 L 6 L 20 L mix 模板 5′端引物 Mix混合液 3′端引物 5′端引物 H2O 3′端引物 总体积 H2O 总体积
2.设置反应参数,进行PCR扩增。按下述程序进行扩增 Step1 94 ℃ 4 min Step2 94 ℃ 50s Step3 55 ℃ 40s Step4 72 ℃ 30s 2 35 Step5 72 ℃ 10 min Step6 8 ℃ Forever
3、检测:琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果。
五、结果与分析 六 、问题与讨论
思考题
引物设计的原则有哪些?如何对PCR条件进行优化?
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