2.聚合酶链式反应技术

一、实验目的

通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验 技术。

二、实验原理聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR) :是体外酶促合成DNA 片段的一种技术。利用PCR技术可在数小时 之内大量扩增目的基因或DNA片段，以用 于基因工程操作。

PCR的原理：用于扩增位于两段已知序列之间的DNA片段，

类似于天然DNA的复制过程。以拟扩增的DNA分子为模板，用一对与待扩增 的靶DNA区段两端序列互补的人工合成的寡核苷酸 片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留 复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的 DNA合成， 重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。

基本反应步骤分三步： 1. 变性 (Denaturation): 加热使模板DNA在高温下变性，双链间 的氢键断裂而形成两条单链。 2. 退火 (复性) (Annealling):

使溶液温度降至50-60℃,模板DNA与 引物按碱基配对原则互补结合。

3. 延伸 (Extension):溶液反应温度升至72 ℃ ,以单链DNA为模板， 在DNA聚合酶的作用下、利用4种 dNTPs 等，从引物 的 3′ 端开始，结合单核苷酸，按5 ′ 向形成与模板链互补的新DNA链。 上述 3 步为一个循环，每经过一个循环，样 本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新 一轮循环的模板，经过25~40个循环后DNA可扩增 106 ~ 109 倍。 3 ′方

早期的PCR技术94℃

55℃

72℃

PCR循环

费事、费力、易出错

PCR的自动化-----快速、简便

PCR基因扩增仪

三、试剂、材料和仪器(1)材料： E.coli DH5 alpha( pGADT7-x ) X来源于P5,300bp 引物序列： At-F:CCGCTCGAG ATGGCAAACTTATTCTT At-R:GAAGATCT TCATTCTAGAACACCTTG (2)仪器 PCR仪 制冰机 微型离心机 移液器

(3)试剂 模板DNA:1-5ng/ml 5u/μl

Taq DNA聚合酶: 0.5 ~ 5 U / 100 μl MgCl2:1.5 ~ 2.0 mM ~ 1 μM

10XPCR缓冲液( Tris- Cl,KCl,BSA) dNTPs :0.02 ~ 0.2 mM

25mM 2mM

10pmol/μL引物(Primer):0.2

水(无菌纯水):补足整个反应体积。

四、实验步骤模板 2 L 1. 反应混合液的配制 10 L 3 L 1.5 L 10 L 1.5 L 0.5 L 5 L 0.5 L 20 L 6 L 20 L mix 模板 5′端引物 Mix混合液 3′端引物 5′端引物 H2O 3′端引物 总体积 H2O 总体积

2.设置反应参数，进行PCR扩增。按下述程序进行扩增 Step1 94 ℃ 4 min Step2 94 ℃ 50s Step3 55 ℃ 40s Step4 72 ℃ 30s 2 35 Step5 72 ℃ 10 min Step6 8 ℃ Forever

3、检测：琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果。

五、结果与分析 六 、问题与讨论

思考题

引物设计的原则有哪些？如何对PCR条件进行优化？