虎源H5N1亚型禽流感病毒感染小鼠模型的建立

为研究H5N1亚型禽流感病毒的病原特性、致病机理及对其疫苗与救治药物效果评价提供平台,利用本室分离鉴定的虎源A/Tiger/Harbin/01/2002株(简称HAB/01)H5N1亚型禽流感病毒进行连续10倍稀释后,对4~6周龄雄性BALB/c小鼠经乙醚麻醉后进行滴鼻攻毒,每个稀释度接种10只实验小鼠

第21卷4期 中 国 病 毒 学 21（4）：353-357

收稿日期：2006-02-13, 修回日期：2006-04-10

* 基金项目：全军医学科研“十五”计划第二批课题（04Z016）；吉林省农业重大科技专项课题（20040202-3-1）。

作者简介：杨松涛（1961-），女，辽宁建昌籍，博士，研究方向为分子病毒学。Tel: 86-431-6985518; E-mail: yst610223@http://www.77cn.com.cn ** 通讯作者：夏咸柱（1939-），男，江苏建湖籍，中国工程院院士。Corresponding author. Tel: 0431-6758799; E-mail: xia_xzh@http://www.77cn.com.cn

为研究H5N1亚型禽流感病毒的病原特性、致病机理及对其疫苗与救治药物效果评价提供平台,利用本室分离鉴定的虎源A/Tiger/Harbin/01/2002株(简称HAB/01)H5N1亚型禽流感病毒进行连续10倍稀释后,对4~6周龄雄性BALB/c小鼠经乙醚麻醉后进行滴鼻攻毒,每个稀释度接种10只实验小鼠

354 中 国 病 毒 学 第21卷

流感造成18人感染，6人死亡，成为首次发生的禽流感病毒直接感染人的事件[8]。2004年至今在东南亚一带暴发了H5N1亚型禽流感，截止到2006年1月5日已经有144人感染，76人死亡。这些严峻的事实在告诉人们，禽流感病毒感染人并且在人群中流行随时可能发生，急需贮备相应的疫苗和救治药

物[9，

10]，及早做好应对准备。

本研究选用本室分离的虎源H5N1亚型禽流感病毒A/Tiger/Harbin/01/2002（HAB/01株）对BALB/c小鼠进行人工感染试验，以期建立哺乳动物流感病毒感染小鼠模型，为探索哺乳动物禽流感病毒的病原特性、致病机理、药物筛选及其疫苗评价提供研究平台。同时，为进一步防控禽流感在人间的暴发流行提供必要的实验参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

虎源A/Tiger/Harbin/01/2002株（简称HAB/01）H5N1亚型禽流感病毒为本实验室分离鉴定，其HA效价为1﹕64；TCID50为10-7.38 /0.05mL；EID50为10-8/0.2mL。SPF级雄性BALB/c小鼠，4~6周龄（体重18~20g），由长春生物制品研究所提供（许可证号：SCXK-2005-0001）。犬肾MDCK传代细胞系引自中国兽药监察所，按常规方法传代培养。0.01M pH 7.2 PBS配制成0.5%的鸡红细胞悬液，4℃保存。RVC-Ⅱ型独立送风隔离笼具购自苏州市冯氏实验动物设备有限公司；SP免疫组化试剂盒购自武汉博士得公司；经典RNA提取试剂盒购自上海生物工程公司；AMV反转录酶及RNA酶抑制剂购自Promega公司；Taq plus DNA 聚合酶及dNTP购自TaKaRa公司。 1.2 小鼠的感染性

实验在本所的BSL-3实验室中进行。将100只4~6周龄雄性BALB/c小鼠随机分为1个对照组和9个实验组。每组10只，分2笼，每笼5只。标记后分别称重。病毒液用MEM液10×连续稀释，标记为10-1、10-2、……、10-9。将小鼠乙醚吸入麻醉后，通过滴鼻途径接种小鼠，每只小鼠的接种剂量为50µL，对照组小鼠经鼻腔滴入等量的生理盐水。独立送风隔离笼具中正常饲养。实验的观察期为14d。实验重复3次，按Reed -Muench方法计算该病毒对小鼠的MLD50[2]。 1.3 临床观察和取样

每日观察记录小鼠的活动状态及临床表现、称量体重。小鼠死亡后立即无菌采集各脏器，置-20℃保存备用。称量每只死亡小鼠的体重及肺脏湿

重，计算其肺指数（肺脏湿重/小鼠体重）。 1.4 光镜和电镜观察

无菌取濒死小鼠的肺、脑等脏器，一部分用甲醛固定、石蜡包埋、常规HE染色，光镜下观察其病理变化；另一部分用2.5%戊二醛固定，制备成超薄切片，透射电镜下进行超微结构观察。将肺脏加2%MEM液研磨，悬液5000r/min离心30min，取上清，透射电镜下进行磷钨酸负染观察。 1.5 免疫组化试验

多聚甲醛固定濒死小鼠脏器，采用SP免疫组化试剂盒，按说明书操作。用本室制备的鼠抗H5N1亚型流感病毒单克隆抗体为一抗，生物素标记的山羊抗鼠IgG为二抗进行免疫组织化学染色，切片中出现棕色或棕黄色颗粒为阳性反应，无此反应则为阴性反应。 1.6 死亡小鼠脏器病毒滴度的测定

用MEM液按1︰10（M/V）将死亡小鼠脏器研磨成乳剂，5000r/min离心10min，上清液加双抗（青霉素、链霉素各1000IU/mL）4℃过夜，7000r/min离心20min，取上清，—70℃保存。各脏器上清液10×连续稀释至10-10，接种于单层培养MDCK细胞的96孔细胞培养板上，每个稀释度接种4个重复孔，CO2培养箱中37℃静止培养，观察记录各孔细胞病变（CPE）情况，连续观察5~7d。按照Reed-Muench方法计算感染小鼠脏器病毒的TCID50。 1.7 PCR检测

根据GenBank中公布的H5N1亚型禽流感病毒核蛋白基因的保守序列设计一对引物：

P1：AGTCCTGCTTGCCTGCTT； P2：AGAGCGACCATTATGGCG， 扩增片段的大小为464bp。常规方法提取RNA，并进行反转录。将反转录产物1.5 μL，加至25 μL PCR反应体系中，瞬时离心后置PCR仪进行扩增。扩增条件：30~35循环，95℃180s预变性，95℃30s变性，56℃30s退火，72℃50s延伸，72℃延伸10min。取阳性标准品及PCR产物各10μL在2.5%的琼脂糖凝胶上电泳约20min，观察电泳条带大小并照相。 1.8 …… 此处隐藏：8758字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……