高产淀粉酶芽孢杆菌菌株的筛选(2)

孢杆菌菌落周围均具有透明圈(图1),说明有分泌淀粉酶的特性,分别测量9株芽孢杆菌的染色圈直径/菌落直径比值,结果见表2。其中菌株编号为Pab03、Pab02的比值较大,分别为2.284、1.961。虽然透明圈的大小直接反映了酶浓度的高低,但不能完全代表菌株产酶能力,其原因是多方面的,固体和液体培养基条件不同;不同菌株具有不同的生长和产酶速度及不同的淀粉酶酶系;菌苔大小及在平板上堆积情况的差异等都会造成透明圈大小不同,所以液体发酵复选必不可少。

表2　淀粉分解菌酶活力初选结果

Table2　Theprimaryscreeningresultsaboutenzymeactivityofamylaceous

Bacillusspp.

求麦芽糖含量的回归方程。

表1　淀粉酶标准曲线的制作

Table1　Drawingstandardcurveofamylase

试管号

Tubenumber123456标准麦芽

蒸馏水∥ml

糖溶液∥ml

Maltosestandardsolution

Distilledwater

麦芽糖含量∥mg

Maltosecontent0.20.61.01.41.83,52二硝基水杨酸∥ml3,52dinitrosali2cylicacid

2.02.02.02.02.0

2.0　　　0

0.2

0.61.01.41.8　　2.0　　　0

1.8

1.41.00.60.2菌株

Strains

菌落直径∥cm染色圈直径∥染色圈直径/菌落直径

Colony1.±0.1.±0.0331.0.±0.0171.571±0.0191.447±0.0721.651±0.0151.004±0.0461.938±0.097

S2.042054±0.0152.101±0.0482.364±0.0462.135±0.0512.175±0.0521.245±0.0262.295±0.113

Stainingcyclediame22.284

1.9611.7101.5791.5051.4751.3171.2401.184

　　(2)粗酶液淀粉酶活力测定。①待测粗酶液的制备。将活化的芽孢杆菌菌液接种于种子培养基Ⅲ中,35℃,培养12

h,然后以5%的接种量接种于发酵培养基Ⅲ中摇床培养,160r/min,37℃培养48h。发酵24hPab02PDM423PSAF1PJK01PSA38

过程中碳酸钙的含量保持在0.02%000r/20min),取20ml,取粗酶液

1ml→2%1ml3ml,于60℃水浴中预

热5min→加浓度mL柠檬酸缓冲液(pH值6.0)1ml,于

60℃水浴中保温30min→加入1.5ml3,52二硝基水杨酸,沸

2.2　3,52二硝基水杨酸显色法测酶活力结果　将初筛有染

水中5min,迅速冷却,加蒸馏水定容至20ml。③空白对照加发酵液后加pH值为3.6以下的酸钝化α2淀粉酶,使酶失活,其余步骤同上。④定容后,摇匀,用分光光度计测定

OD520nm值。

色圈的9株芽孢杆菌作发酵培养试验,经3,52二硝基水杨酸显色法对发酵培养粗酶液淀粉酶活力进行精确测定,结果表明,菌株PSAF1、PKC01、PJK01、Pab01、Pab02、Pab03、Pab04、

PDM423、PSA38所对应的淀粉酶活力分别为(0.366±0.022)、(4.271±(0.704±(17.269±(21.521±0.028)、0.089)、2.731)、(31.331±(4.744±(1.920±1.390)、0.985)、0.065)、0.043)、(1.520±0.089)U。其中酶活力最高的为编号Pab03、Pab02的

在上述条件下以单位体积样品在30min释放1mg麦芽糖所需的酶量为一个麦芽糖单位表示酶活性。

1.2.2　发酵条件的初步优化。从发酵培养基初始pH值、发

酵温度、发酵时间方面对上述筛选到的产酶活力最高菌株进行优化,以提高目的菌的产酶活力。酶活测定方法同3,52二硝基水杨酸显色法。

菌株,这与初选结果一致。菌株的酶活力与国内众多学者测定的范围基本一致。不同芽孢杆菌菌株在不同发酵条件下测定的纤维素酶活力之间存在着很大的差异,其原因是酶的合成受很多因素的影响:首先酶合成受菌体生长速率影响较大,其次酶合成还与诱导物的诱导作用及能量代谢有关。

3　结论与讨论

国内学者对产生淀粉酶的芽孢杆菌的筛选、芽孢杆菌淀粉酶的性质、基因序列分析等也作了大量的研究。张丽苹等

从土壤中筛选出一株能产2种α2淀粉酶的脂肪芽孢杆菌,测定其发酵液酶活为70U/ml[1]。卢涛等分离到一株产α2淀粉酶的凝结芽孢杆菌,经过诱变筛选后发酵液酶活达100

U/ml[6]。柏建玲等对益生素“益畜宝”的有效成分地衣芽孢

杆菌的产酶特性进行了初步定性研究,该芽孢杆菌具有很高的淀粉酶活性[7]。该试验对10株益生菌产淀粉酶的活力进行了筛选,其中9株菌具有分泌淀粉酶的能力,编号为

图1　出现透明圈的芽孢杆菌菌落

Fig.1　Bacillusspp.colonyofappearingtransparentcircle

Pab03、Pab02的2株枯草芽孢杆菌产酶活性最高,在未作发酵