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安徽农业科学,JournalofAnhuiAgri.Sci.2009,37(12):5362-5363,5371　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　张杨林　责任校对　

傅真治

高产淀粉酶芽孢杆菌菌株的筛选

唐丽江,王振华,王迪　(成都农业科技职业学院畜牧兽医分院,四川温江611130)

摘要　[目的]筛选高产淀粉酶的芽孢杆菌菌株。[方法]选用10株芽孢杆菌,采用染色法初选和3,5-二硝基水杨酸显色法复选对其产淀粉酶的能力进行测定,筛选高产淀粉酶的芽孢杆菌菌株。[结果]10株芽孢杆菌菌株中有9株具有产淀粉酶能力,其中编号为Pab03、Pab02的2株枯草芽孢杆菌产酶活性最高,染色圈直径/菌落直径分别为2.284、1.961;在未作发酵条件优化的前提下,其酶活力分别达到(31.331±(21.521±0.985)、1.390)U,在作为新型的消化酶饲料添加剂方面具有广阔的应用前景。而菌株凝结芽孢杆菌PSAF1和枯草芽

(0.704±孢杆菌PJK01所产淀粉酶活力最低,分别为(0.366±0.022)、0.089)U。[结论]成功筛选了2株高产淀粉酶的枯草芽孢杆菌菌株,

分别为Pab03和Pab02。关键词　淀粉酶;芽孢杆菌;酶活力;筛选中图分类号　S182　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2009)12-05362-02ResearchontheScreeningofBacillusStrainProducingHigh2yieldingAmylaseTANGLi2jiangetal　(BranchofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,ChengduVocationalCollegeofSandTechnology,Wenjiang,Sichuan611130)Abstract　[Objective]TheresearchonthescreeningofBacillusstrainwiththeabilityinyieldingod]Thecapacityof10Bacillusstrainsproducingamylasewasprimarilytestedwiththestainingmethodethodof3,52dinitro2salicylicacidforthescreeningoftheBacillusstrainwiththeabilityinhigh2yielding[9hadthecapacityofamylaseproduction,amongwhich,twoBacillussubtilisstrains:Pab03andPab02andetersofthechromatincircleofcolonywere2.284and1.961,respectively.Underthepremiseofnotheenzymeactivitieswere(31.331±0.985)and(21.521±1.390),respectively.Asnewtypeofenzymes,hadwintheapplicationoffeedadditives.ThestraincoagulansBacillusPSAF1andBacillussubtilisPJK01ability2,whichwas(0.366±0.022)and(0.704±0.089),respectively.[Conclusion]TwoBacillussubtiliswinhigh2yieldingamylase2producingweresuccessfullyscreenedout.Keywords　Amylase;;activity　　,是用于酿酒、食品、医药、纺织、目前,在饲料行业由于芽孢杆菌对动物独特的生物学效应,对于高产淀粉酶的芽胞杆菌在动物饲料上应用的研究取得一定进展。配合饲料中含有淀粉、蛋白质、脂肪、纤维素、半纤维素、果胶等多种营养成分,这些营养成分都是由生物多聚物组成,必须依靠水解酶类将其酶解,才能被动物肠道吸收。在饲料中起作用的淀粉酶主要是α2淀粉酶和糖化酶(葡萄糖淀粉酶),α2淀粉酶是将大分子淀粉水解成中等和低分子物质,产生大量新的非还原性末端,有利于糖化酶进一步水解,糖化酶则将α2淀粉酶水解出的一些中、低分子产物,从非还原性末端开始,逐次切下一个个能被动物直接吸收利用的葡萄糖。以芽孢杆菌作为饲料添加剂,一方面芽孢杆菌产生淀粉酶促进饲料中含淀粉营养成分的降解,充分被动物吸收利用;另一方面芽孢杆菌进入消化道能提高内源酶的活性。尤其在动物开始断奶时,因其体内淀粉酶等含量低,不能满足生长发育的需求,若不及时补充淀粉酶等,则会造成消化不良,影响生长发育。所以高产淀粉酶芽孢杆菌的选育已成为饲料行业的一个新突破点。

1　材料与方法1.1　材料

1.1.1　选育菌种。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)6株,菌种

所有菌种均由四川农业大学生物医学工程实验室保存。

1.1.2　培养基。淀粉培养基:可溶性淀粉1%、蛋白胨1%、

葡萄糖0.5%、NaCl0.5%、牛肉膏0.5%、琼脂粉0.8%;种子培养基:牛肉膏0.5%、蛋白胨1%、NaCl0.5%、可溶性淀粉

0.5%,pH值7.0;发酵培养基:玉米粉2%、黄豆饼粉1.5%、CaCl20.02%、MgSO40.02%、NaCl0.25%、K柠檬2HPO40.2%、

酸钠0.2%、硫酸氨0.075%(溶解后加)、Na2HPO40.2%,pH值7.0。

1.1.3　主要试剂和溶液的配制。①0.1%葡萄糖溶液。称取80℃烘干至恒重的无水葡萄糖0.1g,用去离子水溶解,定容

至100ml。②0.1%标准麦芽糖溶液。称取100mg麦芽糖,用蒸馏水溶解并定容至100ml。③1%3,52二硝基水杨酸试剂。称取1g3,52二硝基水杨酸,溶于20ml浓度2mol/L氢氧化钠溶液中,加入50ml蒸馏水,再加入30g四水酒石酸钾钠

(C4H4KNaO6 4H2O),待溶解后用蒸馏水定容至100ml,盖紧

瓶塞,勿使CO2进入。④2%淀粉溶液。称取2g淀粉溶于

100ml浓度0.1mol/mlpH值5.6柠檬酸缓冲液中。1.2　方法

1.2.1　芽孢杆菌淀粉酶活性测定。

1.2.1.1　初选[1-2]。将芽孢杆菌菌种活化,接种在营养肉汤

培养剂中,37℃培养12h,芽孢杆菌液用滴种法接种在淀粉培养基平皿上培养2～4d,采用革兰氏碘液染色,在菌落周围有透明圈产生证明芽孢杆菌产淀粉酶。用游标卡尺分别测量透明圈直径和菌落直径,根据两者比值大小初步确定纤维素酶活性的高低。

1.2.1.2　复选。采用3,52二硝基水杨酸显色法[3-5]。

(1)标准曲线的制作(表1)。①取19支20ml具塞刻度

编号分别为PKC01、PJK01、Pab01、Pab02、Pab03、Pab04;地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)1株,菌种编号为PSA06;蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)2株,菌种编号分别为PSA38、PDM423;凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)1株,菌种编号为PSAF1。

作者简介　唐丽江(1978-),女,四川成都人,硕士讲师,从事动物传

染病学和微生态制剂的开发与应用研究。

收稿日期　2009201220

试管,预先洁净灭菌干燥,编号,按表3加入试剂(每个浓度做3个平行)。②摇匀,至沸水浴中煮沸5min。取出后流水