遗传分子生物学实验

质粒DNA DNA的限制性内切酶酶切 实验二 质粒DNA的限制性内切酶酶切

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一 实验目的了解限制性内切酶作用的原理、特点和酶切质粒DNA的试验方法 了解限制性内切酶作用的原理、特点和酶切质粒DNA的试验方法 DNA

限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的 限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的 DNA DNA水解酶。是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚合酶、 DNA水解酶。是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚合酶、 水解酶 连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。 连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。限制性核酸内切酶不仅是 DNA重组中重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定。 DNA重组中重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定。 重组中重要的工具

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第一类( 第一类(I型)限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点 限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序， 附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没 附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链， DNA分子中的双链 有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中 有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中 DNA 用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。 用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。 DNA结构或克隆基因 第二类(II型 限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序， 第二类(II型)限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内 (II 的固定位置上切割双链。 的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷 酸都是专一的。因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工 酸都是专一的。因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工 DNA 具酶之一。 具酶之一。 第三类( III型 限制性内切酶也有专一的识别顺序， 第三类( III型)限制性内切酶也有专一的识别顺序，但不是对称的回 文顺序,在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。 文顺序,在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几 个核苷酸对不是特异性的。因此， 个核苷酸对不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定 长度DNA片段，具有各种单链末端。因此不能应用于基因克隆。 长度DNA片段，具有各种单链末端。因此不能应用于基因克隆。 DNA片段

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二 实验原理型酶识别的DNA序列一般含有4 个核苷酸。 DNA序列一般含有 Ⅱ型酶识别的DNA序列一般含有4~6个核苷酸。有的在识别顺序 的对称轴

上对双链DNA同时切割产生平末端； 的对称轴上对双链DNA同时切割产生平末端；有的在识别顺序的双侧末 DNA同时切割产生平末端 DNA双链产生粘性末端 双链产生粘性末端。 型限制性内切酶需要Mg2+激活，大部分Ⅱ Mg2+激活 端DNA双链产生粘性末端。Ⅱ型限制性内切酶需要Mg2+激活，大部分Ⅱ 型酶所识别的序列具有反向对称的结构，或称为回文结构。 型酶所识别的序列具有反向对称的结构，或称为回文结构。 质粒DNA通常都具有一个或多个限制性内切酶酶切识别序列， 质粒DNA通常都具有一个或多个限制性内切酶酶切识别序列，可 DNA通常都具有一个或多个限制性内切酶酶切识别序列 被相应限制性内切酶切出相应数量的切口， 被相应限制性内切酶切出相应数量的切口，从而产生相应数量的酶切 片断。 片断。 本实验采用PMD18- 质粒具有EcoRⅠ和Hind的识别序列和酶切位 本实验采用PMD18-T质粒具有EcoRⅠ和Hind的识别序列和酶切位 PMD18 EcoRⅠ 点分别为 GAATTC CTTAAG 和 AAGCTT TTCGAA

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三 实验步骤质粒检测： 质粒检测： 电泳检测：质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、 电泳检测：质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开 环、线型三种构型。 线型三种构型。 吸光值检测：采用分光光度计检测260nm、280nm波长吸光值， 吸光值检测：采用分光光度计检测260nm、280nm波长吸光值， 260nm 波长吸光值 若吸光值260nm/280nm的比值介于1.7-1.9之间，说明质粒质量较好， 若吸光值260nm/280nm的比值介于1.7-1.9之间，说明质粒质量较好， 260nm/280nm的比值介于1.7 之间 1.8为最佳，低于1.8说明有蛋白质污染，大于1.8说明有RNA污染。 1.8为最佳，低于1.8说明有蛋白质污染，大于1.8说明有RNA污染。 为最佳 1.8说明有蛋白质污染 1.8说明有RNA污染

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取实验一中提取的质粒，向其中加入20μL灭菌的双蒸水使其充分 取实验一中提取的质粒，向其中加入20μL灭菌的双蒸水使其充分 20μL 溶解，测定其dsDNA浓度。然后按下表进行操作： 溶解，测定其dsDNA浓度。然后按下表进行操作： dsDNA浓度

实验组 Buffer EcolⅠ Ⅰ Hind Ⅲ 质粒 ddH2O 总体积 4 3 3 X 10-X 20

对照组 0 0 0 X 20-X 20

充分混匀后于37℃保温1 2h。 充分混匀后于37℃保温1-2h。 37℃保温 注最终反应体系中质粒浓度至少达到1.2 1.5μg/μL) 1.2(注最终反应体系中质粒浓度至少达到1.2-1.5μg/μL)

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1

2

3

四 实验结果1泳道 maker 质粒DNA 2泳道 质粒DNA 3泳道 酶切产物

6.0 3.0 2.0

5.7 3.8 1.9

五 注意事项操作过程避免污染，反应体系中各试剂用量准确。 操作过程避免污染，反应体系中各试剂用量准确。

六 习

题

影响限制性酶切的因素有哪些？ 1、影响限

制性酶切的因素有哪些？ 结合实验情况，如何提高限制性酶切的反应效率？ 2、结合实验情况，如何提高限制性酶切的反应效率？ 限制性内切酶在基因工程中有什么作用？ 3、限制性内切酶在基因工程中有什么作用？