CFL2特异性siRNA的设计与筛选及其在C2C12细胞中的定位

设计并合成了2条特异性抑制CFL2的siRNA,用其转染C2C12细胞后分别采用RT-PCR和western blot检测细胞CFL2 mRNA和蛋白的表达情况,并用免疫荧光法对CFL2进行细胞定位。结果表明,设计的2条siRNA均能不同程度地抑制CFL2的mRNA和蛋白表达,当siRNA浓度为50 nmol/L时,其对CFL2-1 mRNA和蛋白的抑制率分别为88%和84%。

安徽农业科学，ora o A h i gi c 2 1 3 (:4 6— 4 8 Junl f n u A r .Si 00,8 7)3 5 3 5 .

责任编辑常俊香

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傅真治

C L F 2特异性 s A的设计与筛选及其在 C C 2细胞中的定位 i RN 2 1张俊峰，苏玉虹 (宁学，宁州10 )辽医院辽锦 20 11摘要设计并合成了2特异性抑制 C L条 F 2的 s N用其转染 C C 2细胞后分别采用 R— C i A, R 21 TP R和 w s r b t测细胞 C L R A和 e en l检 t o F 2m N蛋白的表达情况，并用免疫荧光法对 C L进行细胞定位。结果表明， F2设计的 2条 s N i A均能不同程度地抑制 C L R F2的 m N R A和蛋白表达， s N当 i A浓度为 5 m lL时， R 0n o/其对 C L— m N F 2 1 R A和蛋白的抑制率分别为 8%和 8%。 8 4 关键词 s N;染；白表达； i A转 R蛋定位中图分类号 Q83 1文献标识码 A 文章编号 0 1 6 1 (0 0 0 5 7— 6 l 2 1 )7—0 4 6—0 35 3De i n a r e i g o e i c sRNA n CFL2 a t c to n C2 2 Ce l sg nd Sc e n n f Sp c f i i o nd I s Lo a i n i C1 l s

ZH ANG u - n ta ( io ig Me i l olg, iz o .La nn 2 0 1 J n f g e I La nn d c l e Jn h u io ig 1 1 0 ) e aC eAb t a t 2 l e f sRNA h th d s e i c i hi i o n C J we e d sg e n y t e ie o ta se 2Cl e l h x r s i n s au sr c i so i n t a a p c f n b t n o F『 r e i n d a d s n h t d t r n f r C i i 2 z 2c l s.t e e p e so t t s o fmRNA n r t i f CF i e l wa ee mi e y RT PCR n se l t n h a d p oen o n c ls sd tr n d b — a d we t r b o .a d t e CF i e l s l c t d wi mmu o u r s n n c ls wa o a e t i h n f o e. l c n

e n1 e u h we h tt e d sg e i ec . e r s hs s o d t a h e i n d sRNA a n i i o n e pr s i n o h d i h b t n o x e so fmRNA n r t i fCFL td f r n g e i a d p oeno 2 a i e e t f de r e.a d t e i— n h n h b to a e f5 mo/L sRNA n mRNA n r t i f C儿 2 1 we e 8% a d 8 i iin r t s o 0 n/ i o a d poen o 一 r 8 n 4% r s . e pKe y wor s s RNA: r n f c in:P o en e p e s o d i T a se to r t i x r s i n;Lo a i n ct o

Cfl ( o i丝切蛋白)一个多功能基因，结构和功能高 i n是其

染前 1d在 6孔板上进行爬片， 细胞达到 3%~ 0汇合时 0 5%开始转染，体步骤参照 Iv rgn公司的 o gfc m n具 n ioe t l oet ie i aR ae t明书，i N egn说 s A分别设 5、0 10n lL3个浓度， R 0 10、5 mo /

度保守，可参与细胞运动、分裂和凋亡过程，且对鬼笔环肽也具有重要作用；另外， o l C fi与罕见遗传性肌病和心 i n还脏病、肌营养不良、线性肌病等多种疾病密切相关， o l C fi in高表达可诱导肿瘤细胞的侵袭。C￣l 2 C L r l e— o i ( F 2o n l n H set ecfi)因是 A F cfi y o l基 p in D/ o l s蛋白家族的一员， 2个亚 in有型， C L a和 C L b且 2个亚型拥有一致的 O F即 F2 F2, R。研究表明，该基因与大白猪高肌肉产量——肌纤维的形成有关； 另有研究表明， C L b因高表达对细胞内某些肌球蛋白猪 F2基

转染试剂每孔 3 l ,相应命名 C L—组为 P、2P;F2 F 21 1P、3C L - 2组为 P、5 P ( 6略 ) 0 s N 4 P、6P; i A为 P (照) 3 R c对；7℃、% 5

C, O条件下培养，2h后收集细胞。 7 12 3半定量 R—C .. TP R检测 C L R A的表达。C L F 2m N F 2和

G P H引物南大连宝生物公司合成；

胞总 R A经反转录 AD细 N合成 c N以 G P H为内参与 C L D A, AD F 2进行同管扩增；反应

重链基因具有明显影响，推测猪 C L b凶高表达导致猪 F2基肉品质下降(肉多汁性减少，口感变差 )s。笔者采用 R A L j Ni法成功设计并筛选出了对 C L F 2基因高效特异的 s N以 i A, R期进一步明确该基因与肌肉肉质性状的关系，为相关疾病并

体系按照 M rn等的方法进行优化， ao e扩增条件为：4℃预 9变性 5mi,4℃ 3,6 7℃ 3,2℃ 4 , n9 0s5 . 0s7 5s3 5个循环，电

泳结束后用 G nTo软件对光密度值进行分析； C L与 eeol s以 F2G P H基因的光密度值比值表示 C L N的表达量， AD F 2mR A R A对 C L达的抑制率的计算方法为 (一试验组转染 Ni F 2表 1细胞 C L R A的表达量/照组转染细胞 C L R A的 F 2m N对 F 2m N

的治疗提供理论基础。1材料与方法 11细胞及主要试剂 . C C 2细胞株购白北京协和医科大 21

表达量 )×10。试验重复 3次。 0% 12 4 Wet n bo检测 C L . . s r l e t F 2表达的变化。按 R P IA裂解

学细胞中心。s N i A由上海吉凯基因化学技术有限公司化 R

学合成；B ( yl e;l o ca ie转染试剂 (n ioe ) F S H c n ) oi f tm n o ge Ivt gn; r c l ( at Cue;IC标记的兔抗羊 IG。 o i 2 S na rz) FT i fn g12方法 .

液操作程序提取细胞总蛋白， B A法进行总蛋白定量：用 C将蛋白质等量上样 S SP G D—A E分离，用半干转移系统将采

PG A E分离的蛋白质转到 P D V F膜上，转膜后用含 5%脱脂奶粉的 1x B T室温封闭 2h再以 Jat T S, B ci内参，一抗— n为加 (: 0 ) 1100和一c n一抗 4℃过夜， at i二抗 (: 0 ) 1 100室温反应

12 1 C L i N序列的设计。根据 G nB n . . F 2 s A R ee ak中小鼠

CL F 2基因 m N序列全长 (列号： M一 0 6 8)利用 RA序 N 078, Wh eed s i c、e sr t i ha、 Dr tgn

ci等在线T具设计 s N t i e p i A序列， R只选用与非同源基因有 3个或 3个以上的碱基错配的序列，最

2h D B显色成像， G nT o软件分析 Wet nbo成像 ,A用 ee ol s s r l e t网，获得各组细胞 C L/3at F 2[ ci一 n的相对表达值。 …… 此处隐藏：2378字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……