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高效液相色谱法 HPLC

High Performance Liquid Chromatography概述高效液相色谱仪影响色谱峰扩展及色谱分离的因素高效液相色谱法的主要类型及其分离原理

第一节

概述

一、高效液相色谱法的特点 (1)高压一般可达到150~350×105Pa (2)高速一般都小于l小时 (3)高效可达3万塔板/米以上 (4)高灵敏度紫外检测器的最小检测量可达纳克数量级(10-9 g);荧光检测器的灵敏度达10-11g

高效液相色谱法由于具有上述优点，因而在色谱文献中又将它称为现代液相色谱法，高压液相色谱法或高速液相色谱法。

高效液相色谱适用范围： 气相色谱法的限制：沸点太高的物质或热稳定性差的物质 高效液相色谱法：高沸点、热稳定性差、相对分子质量大(大于400以上)的有机物(这些物质几乎占有机物总数的75%~80%)原则上都可用高效液相色谱法来进行分离、分析。

二、高效液相色谱和气相色谱的比较气相色谱1、只能分析挥发性的物质，只能分析20%的化合物 2、不能用于热不稳定物质的分析 3、用毛细管柱色谱可得到很高的柱效 4、有很灵敏的检测器如 ECD和较灵敏的检测器 (FID和TCD) 5、流动相为气体、无毒，易于处理 6、运行和操作容易 7、仪器制造难度较小

高效液相色谱几乎可以分析各种物质可以用于热不稳定物质的分析色谱柱不很长，柱效较高没有较高灵敏的通用检测器流动相有毒，费用较高运行和操作比GC难一些仪器制造难度较大

三、高效液相色谱法方法的局限性第一，在高效液相色谱法中，使用多种溶剂作为流动相，成本高于气相色谱法，且易引起环境污染。第二，高效液相色谱法中缺少如气相色谱法中使用的通用型检测器(如TCD和FID)。第三，高效液相色谱法不能替代气相色谱法。第四，高效液相色谱法也不能代替中、低压柱色谱法，在 200kPa至 1MPa柱压下去分析受压易分解、变性的具有生物活性的生化样品。

第二节

高效液相色谱仪

一、贮液罐____存放流动相 贮液罐的材料应耐腐蚀，可为玻璃、不锈钢、氟塑料 贮液罐应密闭，以防溶剂蒸发引起流动相组成的变化，还可防止空气中O2、CO2重新溶解于已脱气的流动相中 通常连有过滤器

二、流动相净化常使用G4微孔玻璃漏斗，可除去3~4μm以下的固态杂质 (2)脱气防止产生气泡防止造成荧光猝灭防止样品中某些组分被氧化防止柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能常用的脱气方法有如下几种 (1)吹氦脱气法 (2)加热回流法 (3)抽真空脱气法 (4)超声波脱气法 (5)在

线真空脱气法(on-line degasser)

(1)过滤

在线真空脱气法(on-line degasser)

三、高压输液泵 为达到快速、高效的分离，必须有很高的柱前压力，克服阻力，以获得高速的液流。 (一般要求压力为150~350×105 Pa ) 流量要稳定，因为它不仅影响柱效能，而且直接影响到峰面积的重现性和定量分析的精密度，还会引起保留值和分辨能力的变化。 压力要求平稳无脉动，否则它会使检测器的噪声加大，仪器的最小检测量变坏。

高压输液泵恒流泵恒压泵 (1)往复式柱塞泵___目前较广泛使用的一种恒流泵

(2)气动放大泵 根据液体的压力传导原理： p1 S A= p2 S B

(3)梯度洗提(gradient elution) (又称梯度洗脱、梯度淋洗)装置 载液中含有两种(或更多)不同极性的溶剂，在分离过程中按一定的程序连续改变载液中溶剂的配比和极性，通过载液中极性的变化来改变被分离组分的分离因素，以提高分离效果。 应用梯度洗提还可以使分离时间缩短，分辨能力增加，由于峰形的改善，还可以提高最小检测量和定量分析的精度。

高压梯度____用高压泵增压以后输入色谱系统的梯度混合室，加以混合后送入色谱柱低压梯度____在常压下预先按一定的程序将溶剂混合后再用泵输入色谱柱

四、进样装置(1)注射器进样装置 (2)高压定量进样阀 (常用六通阀)