双抗体夹心ELISA法测定残余汉逊酵母菌体蛋白含量的研究

四川动物２００８年第２７卷第５期

菌体蛋白抗体从５００倍起，用稀释液倍比稀释３个滴度，取１００山加入９６孔酶标板，每个滴度从１至６各加２排，３７‘Ｃ保温１ｈ，洗涤液洗板３次；按说明书，用稀释液将ＨＲＰ标记的羊抗兔抗体稀释成ｌ：３０００，取１００ｕＪ加入包被各孔内，３７℃保温１ｈ，洗涤液洗板３次；加ＯＰＤ底物液１００一，３７℃３０嘶ｎ；加２ｍｏｌ／Ｌ心ｓｏ，１００山终止反应。在多功能酶标仪上测Ａ。值。以阳性孑Ｌ和阴性对照孔Ａ值的最大比ｆＡ来确定包被抗体及榆测抗体的最适使用浓度。

１．２．５标准曲线及线性范围的确定将鼠抗菌体蛋白抗体按摸索的最佳包被浓度包被酶标板Ｂ１～Ｄ５各孔，用稀释液将汉逊酵母菌体蛋白稀释成５００

ｎｇ／ｍｌ、２５０

ｎｇ／ｍｔ、１２５ｎｇ／

ｍｌ、６２．５．ｇ／ｍｌ、３０．ｇ／ｍｌ的溶液，分别加入１—５列，按１．２．４步骤进行ＥＬｌＳＡ实验，根据光吸收值确定标准曲线及线性范围（王键，沈茜，２００５）。

２结果与分析

２．１兔抗菌体蛋白血清效价测定

免疫前每只白兔耳缘静脉取血２ｍｌ作为阴性对照，结果见表Ｉ。从表ｌ可见，当抗血清浓度稀释至１：１００００，阿ｐ眭ＯＤ值／阴性ＯＤ值仍大于２．１，说明免疫后两只自兔的抗血清效价都较高，呵供后面的双抗体夹心ＥＬＩＳＡ使用。

表１

兔抗汉逊酵母菌体蛋白抗血清效价

２．２小鼠抗菌体蛋白血清效价测定（方法同上）

具体结果见表２。采血分离疵清混合后，血清效价也达到１０４。

表２小鼠抗汉逊酵母菌体蛋白抗血清效价

ＥＬＩＳＡ最佳反应条件具体结果见表３。

从表３可看出，当包被鼠抗菌体蛋白抗ＩＩｌＬ清浓度从１０

¨ｇ／ｍＩ稀释到５斗ｇ／ｒｎｌ时，阳性ＯＤ明显下降，而阴性ＯＤ值下降幅度很小；阳性ＯＤ值与阴性ＯＤ值比值最大时，包被抗体的浓度为１０斗∥ｍｌ，兔抗菌体蛋白血清的稀释倍数为１：１０００，因此，包被抗体和检测抗体的最佳反应浓度分别为１０

彬ＩＩｌｌ和１：１０００。

表３包被抗体与检测抗体最佳浓度的确定

Ｓｉｃｈｕａｎ

ＪｏｕｒｎａｌｏｆＺｏｏｌｏｇｙ

Ｖ０１．２７Ｎｏ．５２００８

２．４反应的线性范围

结果见表４。

从表４可以看出，标准菌体蛋白每一稀释浓度的３次重复的吸光度值基本接近。选取酶标板Ｃ排的吸光度值用计算机软件做标准曲线，标准曲线见图１。从标准曲线可见，标准菌体蛋白浓度在３０．ｇ／ｍｌ到５００ｒｉｇ／ｍｌ之间时，标准曲线的线性良好，相关系数为０．９９８５。此方法可检测重组产品中菌体蛋白的残余量。

表４线性范围确定的实验结果

２１．５

靼

ｏｏ

Ｊ

Ｏ．５

Ｏ

Ｏ０．２０．４０．６

菌体蛋白浓度（ｔｔｇ／ｍ１）

图１双抗体夹心ＥＬＩＳＡ法标准曲线图

在基因工程霞组产品中，以汉逊酵母作为表达宿主的越

来越多，特别足汉逊酵母重组乙肝疫苗，菌体蛋白的残余最白的含量，对产品质量的控制具有重要的意义，其检测方法尚在不断的改进和完善巾。目前常用的斑点杂交法，其灵敏通过ＥＬＩＳＡ检测方法检测汉逊酵母残余菌体蛋白含量，具有准确，快速、灵敏。本文通过汉逊酵母荫体伞菌体蛋白免疫小鼠和白兔，得到两种抗汉逊酵母荫体蛋白抗体，建立的双抗体夹心ＥＬＩＳＡ法经摸索，标准曲线范廿；ｌ在３０～５００

ｎｇ／

了基础。

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３讨论

直接关系到产品的质量。快速准确的测定残余汉逊菌体蛋度很高，但对实验人员的操作技能要求高，耗时较长。

２．３

ｍＩ，直线回归系数为０．９９８５。重复性、稳定性都较好，也方便、快速。弥补了目Ｉｊ｛『检测以汉逊酵母为宿主的蘑组产品中残余菌体蛋白含量的空白，为成功研制检测试剂盒的建立打４参考文献

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