安捷伦高效液相

高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)

概述高效液相色谱法(HPLC)是20世纪60年 代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技 术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极 为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经 典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论， 在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏 度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度 高、操作自动化的特点。为了更好地了解高效 液相色谱法优越性，现从两方面进行比较：

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1.高效液相色谱法与经典液相色谱法高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点 在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。高速是指在 分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。由于经典色 谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色谱配备 了高压输液设备，流速最高可达 103cm· -1.例如分 min 离苯的羟基化合物，7个组分只需1min就可完成。对氨 基酸分离，用经典色谱法，柱长约170cm,柱径0.9cm, 流动相速度为30cm3·-1,需用20多小时才能分离出20 h 种氨基酸；而用高效液相色谱法，只需lh之内即可完 成。又如用25cm×0.46cm的Lichrosorb-ODS(5μ )的 柱，采用梯度洗脱，可在不到0.5h内分离出尿中104个 组分.

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2.高效液相色谱法与气相色谱法(l)气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点 较低的化合物，它们仅占有机物总数的20%。对于占 有机物总数近80%的那些高沸点、热稳定性差、摩尔 质量大的物质，目前主要采用高效液相色谱法进行分 离和分析。 (2)气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没 有亲和力，即不产生相互作用力，仅起运载作用。而 高效液相色谱法中流动相可选用不同极性的液体，选 择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固定 相对组分作用的剧烈竞争。因此，流动相对分离起很 大作用，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参 数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便。

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(3)气相色谱一般都在较高温度下进行的，而 高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。 总之，高效液相色谱法是吸取了气相色谱 与经典液相色谱优点，并用现代化手段加以改 进，因此得到迅猛的发展。目前高效液相色谱 法已被广泛应用于分析对生物学和医药上有重 大意义的大分子物质，例如蛋白质、核酸、氨 基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药 物等物质的分离和分析。 高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，操作 严格，这是它的主要缺点。

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20-2 高效液相色谱仪高效液相色谱仪的结构示意见图，一般 可分为4个主要部分：高压输液系统，进样系 统，分离系统和检测系

统。此外还配有辅助 装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。 其工作过程如下：首先高压泵将贮液器中流 动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控 制器的出口流出。当注入欲分离的样品时， 流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入 色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测 器，记录仪将检测器送出的信号记录下来， 由此得到液相色谱图。

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1.高压输液系统

由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相 阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。 它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高压输 液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是 核心部件。对于一个好的高压输液泵应符合密封性好，输出 流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐 腐蚀等要求。常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。恒流 泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱 引起阻力变化无关；恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其 流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重视性差，它 们各有优缺点。目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又称 机械泵，它又分机械注射泵和机械往复泵两种，应用最多的 是机械往复泵。

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2.进样系统高效液相色谱柱比气相色谱柱短得 多(约5~30cm),所以柱外展宽(又 称柱外效应)较突出。柱外展宽是指色 谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包 括进样系统、连接管道及检测器中存在 死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展宽。 进样系统是引起往前展宽的主要因素， 因此高效液相色谱法中对进样技术要求 较严。

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3 分离系统——色谱柱色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与 固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜 及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有 限，故金属管用得较多。一般色谱柱长5~30cm, 内径为4~5mm,凝胶色谱柱内径3~12mm,制备往 内径较大，可达25mm 以上。一般在分离前备有一 个前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这 样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱 和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保 证分离技的性能不受影响。柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填料 (<20μm)一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆， 然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱 内，经冲洗后，即可备用。

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4.检测系统在液相色谱中，有两种基本类型的检 测器。一类是溶质性检测器，它仅对被分 离组分的物理或化学特性有响应，属于这 类检

测器的有紫外、荧光、电化学检测器 等。另一类是总体检测器，它对试样和洗 脱液总的物理或化学性质有响应，属于这 类检测器的有示差折光，电导检测器等。 现将常用的检测器介绍如下:

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(l)紫外检测器 (2)荧光检测器 (3) 示差折光率检测器几乎所有物质都有各自不同的折射率，因此差示折 光检测器是一种通用型检测器。灵敏度可达10-7g· -3。主 cm 要缺点是对温度变化敏感，并且不能用于梯度淋洗。

(4)电导检测器 (5) 附属系统它包括脱气、梯度淋洗、恒温、自动进样、馏分收集 以及数据处理等装置。其中梯度淋洗装置是高压液相色谱 仪中尤为重要的附属装置 .

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20-3高效液相色谱的固定相和流动相(-)固定相高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类， 可分为刚性固体和硬胶两大类。刚性固体以二氧化 硅为基质，可承受7.O×108~1.O×109Pa的高压， 可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二 氧化硅表面键合各种官能团，就是键合固定相，可 扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。 硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚 苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为 3.5×108Pa。固定相按孔隙深度分类，可分为表面 多孔型和全多孔型固定相两类。

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1.表面多孔型固定相它的基体是实心玻璃珠，在玻璃球外面覆盖一 层多孔活性材料，如硅胶、氧化铝、离子交换剂、 分子筛、聚酸胺等。表面活性材料为硅胶的固定 相如国外的Zpax,Corasil I和II,Vydac, Pellosil以及上海试剂一厂的薄壳玻璃珠等；表 面活性材料为氧化铝的固定相，如Pellumina;为 聚酰胺的，如Pellion。这类固定相的多孔层厚度 小、孔浅，相对死体积小，出峰迅速、柱效亦高； 颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能 迅速达平衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚 度薄，最大允许量受限制。

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2.全多孔型固定相它由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成。 如国外的Porasil,Zobbex、Lichrosorb系列， 上海试剂一厂的堆积硅珠，青岛海洋化工厂 的YWG系列，天津试剂二厂的DG系列等。 也可由氧化铝微粒凝聚成全多孔型固定相， 如国外的Lichrosorb ALOXT。这类固定相由 于颗粒很细(5~10μm),孔仍然较浅，传 质速率快，易实现高效、高速。特别适合复 杂混合物分离及痕量分析.