第十五章 现代免疫学技术

一、酶联免疫分析技术免疫技术为检测体液中微量物质的固相免疫测 定方法，称为酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)。 其基本原理是先将已知的抗体或抗原结合在某 种固相裁体上，并保持其免疫活性。测定时， 将待检标本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固 相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应。 用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离成分。 然后加入酶的作用底物催化显色，进行定性或 定量测定。

酶联免疫分析的基本原理和方法类型ELISA可用于测定抗体，也可用于检测抗原。 根据检测目的和操作步骤不向，有以下几种 类型的常用方法。 直接法 间接法 双抗体夹心法 竟争法

间接法此法是测定抗体最常用的方法。将已知抗原吸 附于固相载体，加入待检标本(含相应抗体)与 之结合。洗涤后，加入酶标抗球蛋白抗体(酶标 抗抗体)和底物进行测定。

双抗体夹心法此法常用于测定抗原。 将已知抗体吸 附于固相载体.加入待检标本(含相应 抗原)与之结合。温育后洗涤，加入酶 标抗体和底物进行测定。

竟争法此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定 抗体。 以测定抗原为例.将持异性抗体吸附于固相载体；加 入待测抗原和一定量的酶标已知抗原，使二者竞争与 固相抗体结合；经过洗涤分离，最后结合于固相的酶 标抗原与待测抗原含量呈负相关。

ELlSA方法的技术要点 I固相载体和免疫吸附剂的制备与固相载体结合的抗原或抗体称为免疫吸附剂。将抗 原或抗体固相化的过程称为包被(coating),由于载体不 同，包被的方法也不同。 使用聚苯乙烯制品为载体一般多采用物理吸附法。除 载体的理化性质外，受缓冲液的离子强度、pH值、包 被时的温度和时间等多种因素的影响。 用抗原或抗体包被后。固相载体表面往往尚残留少量 未饱和的吸附位点，产生非特异吸附，导致本底偏高。 为此.常用1%—5%BSA,或含5%—20%小牛血清的 PH9.6碳酸盐缓冲液注满凹孔，37℃作用1h,可以消除 此种干扰。这一过程称为封闭(blocking)。

ELlSA方法的技术要点 II用于制备酶标记物和包被固相载体的抗原要求纯度 高，抗原性完整；抗体需特异、效价高、亲和力强， 并具有较高的比活性。 如将抗体IgG用木瓜蛋白酶水解为Fab片段，再与酶 连接，可以减少非特异性吸附，检测效果更佳。 McAb的应用，进一步提高ELISA法的特异性和灵 敏度。使用针对抗原分子中不同决定簇的两种 McAb分别作为固相抗体和酶标抗体用于双位点夹 心法，简化了操作程序。 通常采用特异性较高的McAb作为固相包被抗体， 与酶标

记的多克隆抗体相结合进行检测，结果更为 满意。

抗原和抗体

ELlSA方法的技术要点 III常用的酶及其底物 在ELISA法中，用于标记抗体或抗原的酶与免疫 酶组织化学技术基本上相同。但所用底物被酶裂 解后，应能生成可溶性有色产物，适合用分光光 度计(酶标仪)测量光密度值，籍以定量测定样品中 待捡抗原或抗体的含量。 辣根过氧化物酶 碱性磷酸酶 半乳糖苷酶 葡萄糖氧化酶

(HRP) (AP) (Gal) (GOP)

OPD, TMB PNP NPG PAP

二、免疫印迹技术免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(Western blotting),是一种借助特异性抗体鉴定抗原的有效 方法。 该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展 起来的一种新的免疫生化技术。 将含有目标蛋白 ( 抗原 ) 的样品首先用 SDS— 聚丙烯 酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)或非变性电泳(Native— PAGE)等分离后，通过转移电泳原位转印至硝酸纤 维素膜或其它膜的表面，然后将膜表面的蛋白质再 用抗原抗体反应进行特异性检测。

Western blot method

Western blot analysis

三、流式细胞术流式细胞仪(Flow cytometer,FCM)能快速、精确地测量 通过检测区液流中的细胞、大分子、乳胶滴或其他粒子。 流式细胞术是应用一个激光和有关的光学检测系统来收 集这些信号以供分析。为免疫学、肿瘤学、细胞遗传学、 病理学、放射生物学、细胞生物学和生物医学研究提供 强而有力的手段。 FCM主要可定量分析细胞表面和细胞内抗原，以及对细 胞分子水平的核酸含量的测量，预示各种病理状态下细 胞的生物行为。 FCM是集现代电子物理技术、激光技术、电子计算机技 术于一身的先进科学仪器，开创了荧光技术的又一个崭 新的领域。

流式细胞仪的细胞分析原理：待测细胞被制成单细胞悬液，经特异 性荧光染料染色后加入样品管中，在 气体压力推动下进入流动室。 流动室内充满鞘液，在鞘液的约束下， 细胞排成单列出流动室喷嘴口，并被 鞘液包绕形成细胞液柱，进入流动室。 被荧光染料染色的细胞受到强烈的激 光照时后发出荧光，被荧光光电倍增 管接收，实现了细胞的定量分析。 再通过流束形成含有细胞的带电液滴 而实现了细胞的分选。

流式细胞仪

四、免疫微粒技术免疫微粒技术是利用高分子材料合成 一定粒度大小的固相微粒作为载体， 包被上具有特异性亲和力的各种免疫 活性物质(抗原或抗体),使其致敏为 免疫微粒，用于免疫学及其他生物学 检测与分离的一项技术。