栀灯注射液中栀子苷_灯盏花素的大鼠药代动力学初步研究

中国生化药物杂志ChineseJournalofBiochemicalPharmaceutics2009年第30卷第6期371

栀灯注射液中栀子苷、灯盏花素的大鼠药代动力学初步研究

梁忠良1,江振洲1,2,张陆勇1,3,秦　勇4,王荣荣1,刘　晶1

(1.中国药科大学江苏省新药筛选中心,江苏南京210009;2.中国药科大学药物质量与安全预警

教育部重点实验室,江苏南京210009;3.中国药科大学江苏省药效研究与评价服务中心,

江苏南京210009;4.江苏神龙药业有限公司,江苏盐城224200)

　　摘　要:目的建立大鼠血浆样品中栀子苷和灯盏花素的高效液相色谱检测方法,并研究栀灯注射液在大鼠体内的药代动力学特征,为其剂量设置提供依据。方法大鼠尾静脉注射栀灯注射液高、中、低3个剂量后检测不同时间血浆中栀子苷和灯盏花素的浓度,并估算药代动力学参数。结果所建立的测定方法对灯盏花素的线性范围为0.2～40μg/mL,对栀子苷的线性范围为0.5～200μg/mL,回收率大于85%,日内及日间RSD均小于10%。静注给予栀灯注射液后,灯盏花素和栀子苷的平均消除半衰期分别为21.6和72.6min,分布容积分别为0.23～1.24和

0.37～1.05L/kg。结论建立的大鼠血浆中灯盏花素和栀子苷HPLC测定方法适合于药代动力学研究。

　　关键词:反相高效液相色谱法;栀灯注射液;灯盏花素;栀子苷;药代动力学　　中图分类号:R969.1　　文献标识码:A　　文章编号:100521678(2009)0620371204

Studyonpharmacokineticsofgeniosideandininjection

LIANGZhong2liang1,JIANG2y21(1.Jiangsu,University,Nangjing210009,China;2.KeyLaboratoryoandPharmacovigilance(ChinaPharmaceuticalUniversity),MinistryofEducation,Nangjing210009,China;3.JiangsuCenterforPharmacodynamicsResearchandEvaluation,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nangjing210009,China;4.JiangsuShenlongPharmaceuticalCo.,

Ltd.,Yancheng224200,China)

　　Abstract:PurposeARP2HPLCmethodwasusedtodeterminegeniosideandbreviscapineinplasmaandtostudyitspharmacokineticsinrat,respectively.MethodsRatplasmasampleswerecollectedafterasingledoseofZhidenginjectionandpharmacokineticparametersofgeniosideandbreviscapinewereestimated,respectively.Re2sultsAgoodlinearrelationshipwasobtainedbetween0.2240.0μg/mLforbreviscapine,and0.52200.0μg/mLforgenioside.Therecoveriesfromplasmawerelargerthan85%,andRSDsofinter2dayasaayandintra2dayassaywerebelow10%.ThepharmacokineticresultsshowedthatgeniosideandbreviscapinewererapidlyeliminatedfromplasmaafterivadministrationofthreedosesofZhidenginjection.Themeanhalf2lifewas72.6minand21.6min,respectively.ConclusionTheestablishedHPLCmethodwassuitableforthepharmacokineticstudyofgenio2sideandbreviscapine.

Keywords:RP2HPLC;Zhidenginjection;breviscapine;genioside;pharmacokinetics

　　栀灯注射液的主要有效成分是栀子苷和灯盏花素,具有改善脑缺血相关的缺血缺氧症状,促进血液

收稿日期:2009205208

基金项目:中医药行业科研专项:中药毒性的评价方法学研究和科学应用(编号:200707008)

作者简介:梁忠良(19812),男,山东潍坊人,硕士研究生;张陆勇,男,通信作者,教授,Tel:025283271500,E2mail:lyzhang@http://。

循环,减轻缺血引起的脑水肿及减少脑梗塞范围,进

而改善相关的神经行为症状的作用[124],目前正在进行临床前研究。本文在相关文献[529]的基础上,建立了HPLC法测定栀子苷和灯盏花素血药浓度的方法,对单次静脉注射栀灯注射液后大鼠体内栀子苷和灯盏花素的药代动力学参数进行了测定,以期为毒性研究和临床用药方案提供参考。

栀灯注射液中栀子苷_灯盏花素的大鼠药代动力学初步研究

3721　材　料1.1　药品与试剂

中国生化药物杂志ChineseJournalofBiochemicalPharmaceutics2009年第30卷第6期

2　方法与结果

2.1　HPLC测定栀灯注射液中栀子苷和灯盏花素方

栀灯注射液,江苏神龙药业有限公司提供;野黄芩苷(批号:1108422200605,含量测定用)、栀子苷(批号:1107492200512,含量测定用)、原儿茶醛(批号:1108102200506,含量测定用),中国药品生物制品检定所提供;甲醇(色谱纯),美国Merck公司。1.2　仪器

LC20102CET液相色谱仪、UV检测器、SIL220AC

法的建立

2.1.1　色谱条件　色谱柱:DiamonsilC18柱(4.6mm×250mm,5μm),栀子苷和灯盏花素检测流动相分别为:0.5%磷酸溶液2甲醇(70∶30)、0.5%磷酸溶液2甲醇(55∶45);检测波长分别为238,335nm;柱温:40℃;流速:1.0mL/min;进样体积:20μL。2.1.2　血浆样品处理　精密量取血浆样品0.1mL置1.5mL离心管中,加入20.0μg/mL内标(原儿茶醛)溶液10μL,混匀,加入甲醇300μL,振荡5min后,16000r/min离心10min,两次,取上清液进样,用样品与内标峰面积比进行定量分析。2.1.3　专属性试验　按2.1.2项方法处理和检测空白血浆、加药血浆和血浆样品,结果表明,血浆内源性物质对药物和内标的检测无干扰,药物和内标峰峰形好,,,见图1～2。

自动进样器、LCSolution1.2.1SP1工作站,日本Shi2madzu公司;TGL216高速台式冷冻离心机,长沙湘仪

离心仪器有限公司;涡旋混合器XW280A型,上海医科大学仪器厂;Milli2Q超纯水纯化仪。1.3　动物

SD大鼠,体重200～300g,雌雄各半,上海西普尔2必凯实验动物有限公司,动物合格证号:SCXK(沪)200320002。给药前禁食12h,自由饮水。

2.1.4　标准曲线与线性范围　分别精密量取灯盏

花素和栀子苷标准溶液适量,置离心管中,分别加入空白血浆0.1mL,旋涡1min,配制成含灯盏花素浓度分别为0.2,0.5,1.25,2.5,5.0,10,20,40μg/mL

及含栀子苷浓度分别为0.5,2,5,10,25,50,100,200

μg/mL的血浆溶液,旋涡混匀后按2.1.2项下方法操作,平行制备5份样品,记录色谱图。利用对照品峰面积与内标峰面积比R对对照品加入量(浓度

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C)作线性回归,得相应的回归方程。灯盏花素为:R=0.250C+0.022,r=0.9999;栀子苷为:R=

0.495C+0.02,r=0.9995。

2.1.5　精密度试验　在空白大鼠血浆中加入不同

量的栀子苷和灯盏花素对照品溶液,得到4种不同

浓度的血浆样品,按2.1.2项下的方法处理后进样,记录色谱图,计算浓度,并计算日内和日间RSD。结果见表1～2。

表1　血浆中栀子苷的精密度测定(n=5)

Tab.1　Precisionfordeterminationofgeniosideinplasma(n=5)

加入浓度μ/(g/mL)

0.5210100

日内

μ测得浓度/(g/mL)

0.53±0.022.00±0.0310.48±0.50106.03±1.90

RSD/%

日间

μ测得浓度/(g/mL)

0.51±0.022.06±0.0510.18±0.39102.97±2.71

RSD/%

4.432.382.661.46

4.353.463.812.64

表2　血浆中灯盏花素的精密度测定(n=5)

Tab.2　Precisionfordeterminationofbreviscapineinplasma(n=5)

加入浓度μ/(g/mL)

0.20.5520

日内

μ测得浓度/(g/mL)

0.19±0.010.50±0.025.60±0.1721.15±0.35

RSD/%

日间

μ测得浓度/(g/mL)

0.20±0.010.50±0.175.6329RSD/%

7.514.233.5.052.1.6　提取回收率考察　0.1m,5000r/min10min,取血浆0.1mL,按

2.1.2项下方法处

理,进样分析。2.2.2　数据分析　将所得血药浓度2时间数据,经DAS2.0软件处理,求算其药代动力学参数。2.2.3　结果　大鼠尾静脉给予栀灯注射液高、中、低3个剂量后测得栀子苷和灯盏花素平均血药浓度见图3,药动学参数见表3～4。

中加入3液,混匀,0.5,5,20μg/mL、g/mL。按2.1.2项下栀子苷浓度分别为2,10,100μ

方法操作,测定样品/内标峰面积比Ra。另将相应的3个浓度的混合对照品液稀释成相等倍数后直接进样,测定样品/内标峰面积比Rs。回收率=Ra/

Rs×100%。每种浓度重复5次。结果灯盏花素的

回收率分别为(94.92±4.09)%,(91.66±3.68)%,(93.76±3.80)%;栀子苷的回收率分别为(104.88±6.34)%,(98.34±5.33)%,(90.52±2.44)%。2.1.7　样品稳定性考察　取离心管数支,精密加入

不同浓度的标准品溶液,加大鼠空白血浆0.1mL,

g/mL、栀子苷浓使灯盏花素浓度分别为0.5,5,20μ

度分别为2,10,100μg/mL。配好后分别采取立即处理、室温放置8h后处理、反复冻融1d、-20℃冰箱中冻存5d后处理。结果表明,血浆样品在室温条件下放置8h、反复冻融1d、-20℃冰箱中冻存5d后处理与立即处理相比较,样品峰和内标峰面积之比无显著变化,提示样品较稳定。2.2　药动学参数的测定

2.2.1　实验方案　取SD大鼠18只,按体重分层随

-◆-.64mg/kg;-■-.32mg/kg;-▲-.16mg/kg

图3　大鼠给予栀灯注射液后栀子苷(A)和灯盏花素(B)的平均药2时曲线

Fig.3　Meanplasmadrugconcentration2timecurvesofgenioside(A)andbreviscapine(B)inratsaftersingleintravenousadministra2tionof64,32,16mg/kgZhidenginjection

3　讨　论

机分成高、中、低剂量组,每组6只,雌雄各半,分别尾静脉注射栀灯注射液64,32,16mg/kg。于给药前和给药后2,5,10,15,30,45min,1,1.5,2,3,4h眼眶

栀灯注射液中的灯盏花素是指灯盏花乙素,因

为灯盏花素中98%以上都是灯盏花乙素,所以通常统称为灯盏花素。　　本实验通过同时研究栀灯注射液中的两个主要

栀灯注射液中栀子苷_灯盏花素的大鼠药代动力学初步研究

374中国生化药物杂志ChineseJournalofBiochemicalPharmaceutics2009年第30卷第6期表3　静脉注射64,32,16mg/kg的栀灯注射液后栀子苷和灯盏花素的药代动力学参数

Tab.3　Pharmacokineticparametersofgeniosideandbreviscapinefollowinginjectionof64,32,16mg/kgZhidenginjectioninrat

参　数

t1/2/hCL/L/hV/L

640.97±0.350.73±0.101.05±0.480.37±0.04

栀子苷剂量/(mg/kg)

32

1.64±0.540.45±0.071.06±0.380.44±0.0530.70±4.3731.97±4.56

160.62±0.100.43±0.150.37±0.080.36±0.0917.52±5.5517.97±5.66

64

灯盏花素剂量/(mg/kg)

32

1.26±0.071.00±0.140.37±0.050.20±0.051.95±0.272.03±0.30

16

0.64±0.271.37±0.221.24±0.470.37±0.145.73±0.815.95±0.85

0.13±0.051.18±0.360.23±0.140.12±0.020.89±0.270.91±0.26

MRT/h

AUC02t/(mg h/L)AUC02∞/(mg h/L)

76.92±11.0877.73±10.85

成分栀子苷和灯盏花素的药代动力学行为,了解栀灯注射液在大鼠体内的处置过程,为药效学研究、毒理学研究提供剂量设置依据。

本文建立了大鼠血浆中栀子苷和灯盏花素的HPLC测定法,研究结果表明该法具有专一性强,重现性和精密度好,回收率高和样品处理简单等特点,适合于生物样品分析。

血浆样品处理方法采取甲醇直接沉淀蛋白后进样,方法简便、快速。曾尝试了其他提取方法,但由于栀子苷和灯盏花素为水溶性成分,萃取时,回收率低,效果不好时,选用C18了色谱峰形,。

药动学研究的结果表明,静脉注射给药后灯盏花素迅速从大鼠血浆中消除,其平均消除半衰期仅为21.6min,栀子苷消除也较为迅速,其平均消除半衰期为72.6min。

本实验在灵敏度方面,还有待进一步研究改进。

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