草莓枯萎病菌的分离、鉴定及生物学特性

于红梅，赵密珍，王　静，等．草莓枯萎病菌的分离、鉴定及生物学特性［Ｊ］．江苏农业科学，２０１３，４１（１１）：１２４－１２７．

草莓枯萎病菌的分离、鉴定及生物学特性

于红梅，赵密珍，王　静，孟宪风

（江苏省农业科学院园艺研究所，江苏南京２１００１４）

　　摘要：应用ＰＣＲ技术，结合形态学手段，对草莓枯萎病病原菌种类进行鉴定，从江苏省农业科学院草莓生产基地

采集草莓枯萎病株，对草莓枯萎病病原菌进行分离鉴定。在ＰＤＡ培养基上用单孢分离法培养出３个单菌系，用交叉显微镜初步鉴定该病原物为草莓枯萎病病原菌尖孢镰刀菌。以这３个菌系ＤＮＡ为模板，利用真菌通用引物ＩＴＳ１、ＩＴＳ４对单菌系进行ＰＣＲ扩增，获得５４４ｂｐ转录间隔区片段（ＩＴＳ），序列测定、Ｂｌａｓｔ搜索比对结果表明，３个单菌系序列完全一致，与番茄枯萎病病原菌的１８ＳｒＲＮＡ转录间隔区同源性达１００％，均属尖孢镰刀菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）。以ＰＤＡ为培养基，采用十字交叉法测定草莓枯萎病菌的生物学特性，结果表明：草莓枯萎病菌在１５～３５℃、ｐＨ值为４～８范围内均生长较好，最适温度为３０℃，ｐＨ值为５～８时菌落变化不明显。　　关键词：草莓枯萎病；生物学特性；分离；培养

０１２４－０３　　中图分类号：Ｓ４３６．６８　　文献标志码：Ａ　　文章编号：１００２－１３０２（２０１３）１１－

　　草莓（ＦｒａｇａｒｉａａｎａｎａｓｓａＤｕｃｈ．）属蔷薇科草莓属多年生

草本植物，果肉鲜美多汁，堪称“水果皇后”。草莓上市时间适逢鲜果匮乏期，且采摘持续时间长。近年来，草莓种植面积逐年增大，品种不断更新，频繁地调种、引种以及连作，导致草莓枯萎病蔓延。草莓枯萎病是由尖孢镰刀菌草莓专化型（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ．ｓｐ．Ｆｒａｇａｒｉａｅ）从根部侵染引起的系统性病害，从苗期到收获期都会发生。草莓感染草莓枯萎病后，地上部分表现为心叶变黄绿、卷曲呈船形、两边不对称，叶片无光泽，叶柄及根部维管束变褐色或黑褐色，地下根系黑褐

［１］

色，不长新根。该病可导致草莓结果减少、果实无法正常

［２－３］

。目前已有关于利用形膨大、品质降低，甚至全株枯死

态学鉴定草莓枯萎病的报道。ＰＣＲ技术由于具有灵敏度高、准确、快速等优点，已被广泛应用于植物病理学诊断领［４－５］域。本研究应用ＰＣＲ技术，结合形态学手段，对草莓枯萎病病原菌种类进行了鉴定，旨在为草莓枯萎病抗病育种工作提供参考。１　材料与方法

１．１　材料

草莓枯萎病株于２０１０年８月采自江苏省农业科学院草莓繁苗基地。１．２　试剂

Ｔｒｉｓ－ＨＣｌＡＲ、ＥＤＴＡＡＲ、磷酸钠ＡＲ、ＮａＣｌＡＲ、ＣＴＡＢ、Ａｇａｒｏｓｅ、ＰＭＤ１８－ＴＶｅｃｔｏｒ、Ａｍｐ、胰蛋白胨、酵母提取物、无水乙醇ＡＲ。１．３　仪器

Ｏｌｙｍｐｕｓ交叉显微镜、ＢｉｏｍｅｔｒａＰＣＲ仪、ＢｅｃｋｍａｎＸ－２２Ｒ

收稿日期：２０１３

基金项目：江苏省农业科技自主创新资金［编号：ＣＸ（１２）３０１２］。作者简介：于红梅（１９７６—），女，江苏兴化人，硕士，助理研究员，主要从事草莓抗病育种研究。Ｔｅｌ：（０２５）８４３９０２１９；Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｈｍｊｓｘｈ＠１６３．ｃｏｍ。

冷冻离心机、Ｔａｎｏｎ３５００凝胶成像系统、华利达ＺＤ－９５５６水

平摇床等。１．４　方法１．４．１　草莓枯萎病菌株的分离、纯化　采用常规分离法，将病株根用自来水冲洗干净并晾干，在无菌操作台用７５％乙醇消毒３０ｓ，０．１％ＨｇＣｌ２浸泡６０ｓ，无菌水换洗３次；取１ｃｍ长病株根在无菌水中纵切成４份，再次移入ＰＤＡ平板培养，用

［６］

连续稀释法经单孢分离纯化后获得供试菌株。ＰＤＡ培养基成分：马铃薯２００ｇ，葡萄糖２０ｇ，琼脂２０ｇ，蒸馏水１０００ｍＬ。　１．４．２　草莓枯萎菌菌丝、孢子形态　挑取纯化后菌株的边缘菌丝置于含ＰＤＡ的凹凸载玻片中，２５℃下置于灭菌培养皿中培养３ｄ，观察草莓枯萎菌菌丝、孢子形态。１．４．３　温度、ｐＨ值对菌丝生长及产孢的影响　用Ｎａ２ＨＰＯ４和柠檬酸，ＮａＯＨ和Ｎａ２Ｂ４Ｏ７配制ｐＨ值分别为４畅０、５．０、６．０、７．０、８．０的ＰＤＡ培养基，接种直径为５ｍｍ的菌饼，２８℃下培养，每处理重复３次，第５天测菌落直径，第１０天测产孢子量。将直径为５ｍｍ的菌饼接种到ＰＤＡ平板上，分别置于５、１０、１５、２０、２５、３０、３５℃等７个温度下培养，每处理重复３次，第３天测菌落直径。１．５　ＰＣＲ检测

［８－１０］

［７］

采用ＣＴＡＢ法提取ＤＮＡ。ｒＤＮＡ－ＩＴＳ扩增引物序列：ＩＴＳ１为５′－ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ－３′，ＩＴＳ４为５′－ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ－３′。ＰＣＲ反应体系：１．０μＬＤＮＡ模 …… 此处隐藏：5310字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……