陈译Lipofectamine 2000中文使用说明书
时间:2025-04-03
时间:2025-04-03
读博士时候自己翻译的Lipofectamine 2000说明书,希望对您有用。
陈译LipofectamineTM 2000
使用说明书
产品特点
Lipofectamine 2000转染真核细胞具有以下优点:
对多种细胞和培养器皿具有很高的转染效率,成功转染的细胞系
见http:// Cell Lines数据库。
核酸-Lipofectamine 2000复合物(转染液)可直接加入细胞培养基中,不管
培养基是否含有血清。
转染后不必去除转染液,或者改变或添加培养基,但转染4-6小时后可去除
转染液。
注意事项
推荐在混合前使用Opti-MEM I低血清培养基(Cat. No. 31985-062)稀释
Lipofectamine 2000和核酸。
转染过程中勿向培养基中添加抗生素,以免造成细胞死亡。 不同批实验请保持细胞接种条件相同。
请检测无血清培养基与Lipofectamine 2000的兼容性,因为一些无血清培养
基(如CD293, SFM II, VP-SFM等)可能抑制阳离子脂质体介导的转染。
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脂质体RNAi或siRNA转染
下列步骤适用于24孔板培养的哺乳动物细胞,至于其他培养材料,请参考转染规模调整,所有数量和体积均是按每孔计算。
1. 转染前一日,将细胞接种于500 μl不含抗生素的培养基中,使其在转染时长
至30-50%融合。
2. 转染液制备,每孔细胞用量如下:
A. 用50 μl Opti-ME I低血清培养基(或者其他无血清培养基)稀释20 pmol
siRNA(转染时siRNA终浓度为33 nM),轻轻混匀。
B. 使用前轻轻摇匀Lipofectamine 2000,然后取1 μl Lipofectamine 2000在
50 μl Opti-ME I培养基中稀释,室温孵育5分钟。注意:请在25分钟内进行下一步操作。
C. 将前两步所稀释的DNA和Lipofectamine 2000混合(使总体积为100 μl),
轻轻混匀,室温放置20分钟(溶液可出现浑浊)。
3. 在每孔细胞中加入100 μl转染液,轻轻摇匀。
37℃培养24-96小时后检测基因表达,转染4-6小时后可更换培养基。
脂质体siRNA转染优化
可调整siRNA与Lipofectamine 2000的用量以优化转染,在24孔板,siRNA可在10-50 pmol之间调整,Lipofectamine 2000可在0.5-1.5 μl之间调整,在增加细胞密度时也应优化转染剂量。更多RNAi转染技巧可参考《成功RNAi七步法》(http:///rnai)。
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脂质体DNA转染
下列步骤适用于24孔板培养的哺乳动物细胞,至于其他培养材料,请参考转染规模调整,所有数量和体积均是按孔计算。大部分细胞系所使用的DNA(μg)与Lipofectamin 2000(μl)的比值为1:2到1:3,转染高密度细胞可获得高转染效率、高表达水平和低细胞毒性。优化转染是必需的(见优化脂粒DNA转染)。 1. 贴壁细胞:转染前一天每孔0.5-2×105个细胞接种于500 μl不含抗生素的培
养基中,在转染时细胞可长至90-95%融合。
悬浮细胞:在配制转染液前每孔4-8×105个细胞接种于500 μl不含抗生素的培养基中。
2. 转染液制备,每孔细胞用量如下:
A. 用50μl Opti-ME I低血清培养基(或者其他无血清培养基)稀释质粒DNA,轻轻混匀。
B. 使用前轻轻摇匀Lipofectamine 2000,然后取适量Lipofectamine 2000在50 μl Opti-ME I培养基中稀释,室温孵育5分钟。注意:请在25分钟内进行下一步操作。
C. 将前两步所稀释的DNA和Lipofectamine 2000混合(使总体积为100μl),轻轻混匀,室温放置20分钟(溶液可出现浑浊)。注意:转染复合物常温下可在6小时内保持稳定。
3. 在每孔细胞中加入100 μl转染液,轻轻摇匀。
4. 37℃培养18-48小时后检测基因表达,转染4-6小时后可更换培养基。 5. 对于稳定转染,在转染24小时后以1:10稀释接种于新鲜培养基中,第二天可加入选择培养基。
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优化脂质体DNA转染
可通过改变细胞密度、质粒DNA密度和Lipofectamine 2000浓度以优化转染。要保证细胞融合在90%以上,DNA (μg): Lipofectamin 2000 (μl)可在1:0.5到1:5之间进行调整。
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转染规模调整
不同培养材料转染液、细胞和培养基的用量按照培养材料面积换算。在96孔板细胞高通量自动分析系统,推荐每孔使用50 μl转染液。注意:在96孔板,可将细胞直接接种于转染液中以实现快速转染,直接在培养板中配制转染液100μl,直接将细胞加入培养板中,其密度为上述方法的2倍,细胞在转染液中可正常贴壁。
2009年6月于中山大学肿瘤防治中心
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