浅析昆虫（螨）酯酶与抗药性的关系

王祥尊

（西南大学植物保护学院农药学，重庆）

摘要：随着化学农药广泛应用，害虫对农药的抗性不断增强。目前，昆虫（螨）抗性机制研究已成为一项重要的课题。现代分子生物学技术的运用使有关抗性机制的研究呈现多层次 多方位的研究特点。本文概述了近年来几种与昆虫抗药性机制相关酯酶的研究进展，以期为昆虫的抗性研究提供参考。

关键词：昆虫；酯酶；抗药性；关系

Analysis the Relationship of Insect (Mite) Esterases and Pesticide Resisitance

Wang XiangZun, (Department of Pesticide, College of Plant Protect, Southwest University, China) Abstract: With the extensive application of chemical pesticides, Pest resistance to pesticides more and more seriously. Currently, the insects (mites) resistance mechanism has become an important issue. The use of modern molecular biology techniques to study the resistance mechanisms present multi-level multi-aspect characteristics. This paper reviews several recent research of insect resistance mechanisms associated with the esterase, providing a reference to study insect resistance.

Key words: insect; resisitance; esterase; relationship

世界卫生组织（WHO）1957年对昆虫抗药性下的定义是：“昆虫具有忍受杀死正常种群大多数个体的药量的能力在其种群中发展起来的现象”。自1908年Melander首次发现美国的梨园蚧（Diaspidivtus pernicivsus）对石硫合剂产生抗性以来，害虫抗药性的研究已有近100年的历史。

昆虫抗性研究从最初的行为、生理到代谢再到作用靶标，实现了跨越式发展。近年来，昆虫抗性机制的研究主要集中于抗性基因的表达和调控。大多数研究认为，昆虫的抗药性机制主要包括药剂穿透率下降、昆虫体内解毒酶活力增强即代谢抗性与靶标敏感性降低等。其中解毒酶主要包括细胞色素P450介导的多功能氧化酶、谷胱甘肽转移酶(GST)、水解酯酶等；3个主要作用靶标分别为乙酰胆碱酯酶（AChE）、神经轴突钠离子通道（SC）和γ-氨基丁酸（GABA）受体-氯离子通道复合体。而随着昆虫基因组全序列的测序完成以及基因组研究技术的开发运用，大大地促进了抗性基因的鉴别，使昆虫的抗性机制研究在代谢机制和作用靶标这两方面取得了重大突破。

1 昆虫酯酶的命名与分类

目前酯酶的分类比较混乱。有时所用的术语仅描述某些反应，如“磷酸酯酶”水解P-O-C键，“酰胺酶”水解酰胺键，“羧酸酯酶”水解羧酯键。在早期的文献中，Augustinsson（1961）基于水解的底物把酯酶分成三类: 1）脂族酯酶（水解脂族酯底物）；2）芳族酯酶（水解芳族酯底物）；3）胆碱酯酶（水解胆碱酯）。事实上这种分类方法对脂族酯酶和芳族酯酶很难清楚区分。在该分类方法中最常用的一个标准是非变性电泳中的不同迁移率，例如桃蚜的酯酶 El-E7（Devonshire, 1975）和果蝇的酯酶 Est2 和 Est5（Zouros et al., 1982）。Aldridge（1953）则根据酯酶与有机磷的相互作用把酯酶分为三类: 1）A-酯酶，这类酶能耐受有机磷，并把它们作为底物进行水解；2）B-酯酶，这类酶对对氧磷等有机磷很敏感，能被这些有机磷抑制；3）C-酯酶，既不被有机磷抑制，又不能水解这些有机磷。按照国际生化联合会的分类：羧酸酯酶（=脂族酯酶=B酯酶），分类名为羧酸酯水解酶；芳族酯酶（=A酯酶=对氧磷酶），分类名为芳族酯水解酶。但实际上羧酸酯酶也能分解芳族酯类，芳族酯酶也能分解脂族酯类，因此这种分类方法也未必合理。由于许多A-酯酶能通过活性位点上乙酰化的半胱氨酸水解有机磷，因此这些酶被通称为磷酸酯酶（Reiner, 1993；Walker, 1993）。羧酸酯酶主要指B-酯酶，这些酶具有一个丝氨酸活性位点，因此B-酯酶和丝氨酸水解酶是同义的。

2 昆虫酯酶与抗药性的研究

酯酶是指能够水解羧酸酯键和磷酸酯键的酶的通称，属于丝氨酸水解酶家族，是代谢多种杀虫剂的一大类酶，其作用在于优先水解水溶性短链酯类的酯键。在国外对酯酶基因的克隆研究很活跃，已有几种微生物和抗性昆虫酯酶基因得到克隆和表达，并证明有的酯酶参与半纤维素的降解（Dalrymple et al., 1996），有的参与芳香烃类化合物的降解代谢（Nordlund and Shingler, 1990），有的在有机合成中发挥重要作用（Nishizawa et al., 1993）。而国内这方面的研究起步较晚，但目前发展速度较快。

2.1 昆虫磷酸酯酶与抗药性的关系

磷酸酯酶也称为A-酯酶，包括碱性磷酸酯酶（Alkaline phosphatase，EC 3.1.3.1，简称ALP）和酸性磷酸酯酶（Acid phosphatase, EC 3.1.3.2, 简称ACP），是昆虫体内重要的解毒酶系，在对外源化合物特别是有机磷化合物的解毒代谢和昆虫对杀虫剂的抗性机制中起着重要的作用（张文吉等，1996； 陈巧云等，1980）。唐振华等（1991）研究酸性磷酸酯酶在抗敌百虫和敏感品系淡色库蚊（Culex pipiens pallens）不同发育期中的变化，发现两个品系幼虫发育期的酸性磷酸酯酶水平均较低，而在变态期的酸性磷酸酯酶活性突然上升为最高，而不同品系间无明显差异，表明酸性磷酸酯酶可能参与蚊虫的发育和分化。颜增光等（2003）研究光活性毒素α-三噻吩对棉铃虫（Helicoverpa armigera）和亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）

酸性磷酸酯酶和碱性磷酸酯酶等水解酶离体活性的影响，表明高浓度α-三噻吩可使棉铃虫和亚洲玉米螟碱性磷酸酯酶活性降低，α-三噻吩还可诱导棉铃虫酸性磷酸酯酶活性升高，但不影响亚洲玉米螟酸性磷酸酯酶活性，光照条件下高浓度α-三噻吩对两种昆虫碱性磷酸酯酶和酸性磷酸酯酶离体活性均有抑制作用。

2.2 昆虫乙酰胆碱酯酶与抗药性的关系

乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase，AChE；EC 3.1.1.7）属于水解酶，是生物神经传导中的一种关键性酶，能够迅速水解兴奋性神经递质乙酰胆碱而保持神经突触传导的正常进行。在昆虫中，AChE是有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的重要作用靶标。有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂在与酶分子作用时，其方式与乙酰胆碱类似，先与酶形成复合物，然后再将酶磷酰化或氨基甲酰化，钝化酶的活性而阻断正常的神经传导，神经传导的阻断必然会影响整个生理生化过程的失调与破坏，最终造成昆虫的死亡（唐振华和吴士雄，2000）。不敏感AChE是昆虫对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂产生抗性的重要原因之一（Hama, 1983; Fournier and Mutero, 1994）。害虫可以通过其体内AChE质与量的变异而对杀虫剂的抑制作用产生抗性。也即抗性昆虫AChE结构并未改变只是活性提高（Charpentier and Fournier, 2001），或者是其结构发生了改变导致对这两种杀虫剂的敏感性下降。

2.2.1 昆虫（螨）AChE基因点突变与抗药性的关系

最早有关AChE 基因的变构引起的对杀虫剂敏感度的降低是Smissaert于1964年在二斑叶螨Tetranychus urticae中发现的。此后相继在铜绿蝇、黑腹果蝇、家蝇、桃蚜、冈比亚按蚊等昆虫中发现了抗性突变位点（Schuntner and Roulston, 1968; Mutero et al., 1994; Weill et al., 2003 ; Coutinho-Abreu et al., 2007 ; Jiang et al., 2009）。昆虫对杀虫剂产生抗性的一个重要原因就是由于AChE基因的突变导致其编码的蛋白对杀虫剂敏感度降低。

目前认为，一些AChE的敏感性下降，主要是基因的点突变所致。由于有些昆虫中存在一种以上的AChE基因，所以在不同的昆虫中，抗药性可能是由Ⅰ型AChE基因或者Ⅱ型AChE基因的突变所引起的。

在对有些抗性昆虫的研究中，只发现了Ⅰ型AChE的存在，或者尽管存在不敏感的Ⅱ型AChE，但并没有在Ⅱ型AChE中发现与抗性相关的突变位点。Nabeshima等（2003）在桃蚜Myzus persicae氨基甲酸酯高抗品系中发现，Ⅰ型AChE中存在一个S431（331）F突变，作者认为该突变导致了桃蚜对氨基甲酸酯的抗性。Anazawa等（2003）在二斑叶螨的有机磷抗性品系中发现一个F439（331）C的氨基酸替换，并认为该突变与不敏感的AChE的存在相关。Weill等（2003）在冈比亚按蚊Anopheles gambiae和尖音库蚊C. pipiens中，发现G119S单位点突变导致对残杀威的抗性。Li和Han（2004）报道，同敏感品系Ⅰ型AChE比较，在棉蚜5个有机磷和氨基甲酸酯抗性品系中，发现了多个氨基酸替换，其中A302（201）S、V332（231）A、R599（495）H和V637（533）A这4个替换在5个抗性品系中都存在，而

且A302（201）S可能是与抗性相关的突变位点。Benting和Nauen（2004）研究认为棉蚜抗性品系102的Ⅰ型AChE S431F突变导致了棉蚜对抗蚜威的抗性。Andrews等（2004）证实，棉蚜抗蚜威抗性品系1081K的Ⅰ型AChE具有一个S431F突变；有机磷及氨基甲酸酯抗性品系968E的Ⅰ型AChE具有S431F和A302S双突变，这两个突变导致了棉蚜对有机磷和氨基甲酸酯的抗性。二斑叶螨Tetranychus urticae和神泽叶螨T.kanzawai中目前只克隆到一个AChE基因，该基因更接近于昆虫Ⅰ型AChE基因（Yasuhiko et al., 2005）。Yasuhiko等（2005）在神泽叶螨有机磷抗性品系中发现一个F439W的突变，并认为该突变在神泽叶螨的抗性中起重要作用。Ji等（2005）发现小菜蛾Plutella xylostella抗丙硫磷（prithiofos）品系Ⅰ型AChE基因片段上存在G227A突变，并认为该位点可能导致了小菜蛾对丙硫磷的抗性。陈茂华（2005）研究发现禾谷缢管蚜抗蚜威抗性品系Ⅰ型AChE的S329（228）P替换和麦长管蚜抗蚜威抗性品系Ⅰ型AChE的L436（336）S替换均与抗性相关。

然而在昆虫（螨）抗药性相关的Ⅱ型AChE基因突变位点研究中，Fournier等（1992）研究马拉氧磷抗性果蝇品系MH19的AChE基因时发现，该品系存在一个点突变T/A，导致Phe368突变为Tyr，而且该突变导致MH19品系对多种有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂产生抗药性。Mutero等（1994）在3个有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂抗性果蝇品系（Saltillo、Bygdea、和Pierrefeu）中共发现了4个位点处的5个突变：F115（78）S、I199（129）T、I199（129）V、G303（227）A和F368（290）Y，F115S只在Saltillo品系中出现，I199（129）V在Bygdea品系中出现，I199（129）T在Pierrefeu品系中出现，G303（227）A在3个品系中都出现，F368（288）Y在Saltillo品系中出现，将这些突变通过定点诱变导入野生基因型，并在爪蟾卵母细胞中功能表达，结合毒理学分析发现，单个突变存在时，则表现很低的抗性，而不同点突变的组合则可产生高水平抗性。Walsh等（2001）在4个家蝇抗性品系中共发现5个突变位点：V180（150）L、G262（227）A、G262（227）V、F327（290）Y、G365（328）A，其中V180L突变出现在品系77M中，G262A出现在CH2和77M中，G262V出现在品系690a中，F327Y在品系CH2、77M、690a中都存在，G365A出现在品系49R中，并证实单个位点或者几个位点联合作用会导致家蝇对杀虫剂形成不同程度的抗性。

在农业害虫方面，Zhu等（1996）研究发现马铃薯甲虫抗性品系中980位点Ser/Gly的替换引引起了AChE敏感性的下降。Ren等（2002）研究认为棉铃虫Helicoverpa armigera抗久效磷品系中585位点Ala/Thr的替换可能与该抗性品系的敏感性下降有关。Li和Han（2004）报道，同敏感品系的Ⅱ型AChE相比，F139（78）L氨基酸替换在棉蚜有机磷和氨基甲酸酯抗性的北京、安阳、莱阳、南京和泰安品几个品系中都存在，而N259S氨基酸替换只在安阳品系中存在，莱阳品系中存在H177R和L533（452）S等3个氨基酸替换，Y133

（72）H和Y191（120）H 2个替换为北京品系特有，南京品系存在G188（117）D和S401（320）G两个特有的替换，同时认为北京、安阳、莱阳、南京和泰安品系中存在的F139（78）L可能是与抗性相关的突变位点。陈茂华（2005）研究发现禾谷缢管蚜抗蚜威抗性品系Ⅱ型

AChE的F368（290）L和V435（356）A替换和麦长管蚜抗蚜威抗性品系Ⅱ型AChE的W516（435）S替换均与抗性相关。

经研究发现，许多抗性品系昆虫中的AChE氨基酸突变大多数位于酶的活性位点附近。害虫通过其AChE活性中心氨基酸序列的改变，改变蛋白酶的性状，影响杀虫剂与酶的结合过程，进而对杀虫剂产生不同程度的抗药性。

2.2.2 昆虫乙酰胆碱酯酶的量变与抗药性的关系

从理论上推断，昆虫AChE在体内表达量的升高可能导致抗性的形成，但目前有关AChE量变与昆虫抗性关系的报道较少。

Pinsker（1981）在筛选对硫磷和倍硫磷抗性果蝇品系时发现，随着选育品系抗性倍数的增加，AChE的活力也有增加的趋势，选育得到的抗性品系AChE的活力是原初品系的近十倍。尽管我们不能排除酶的质的变化导致了这种活力的增高，但酶活力增加的过程证明了这种假设可能成立。Charpentier和Fournier（2001）通过AChE抑制剂MEPQ滴定法研究发现，从几个国家采集的果蝇品系，对对硫磷的抗性水平与其体内AChE的量有很大的相关性。Gao等（2002）通过Northern杂交研究发现，有机磷抗性品系的麦二叉蚜Schizaphis graminum AChE的量比敏感品系高约1.5倍，由此推断AChE表量的变化可能是麦二叉蚜对有机磷抗性的原因。这与Charpentier和Fournier（2001）的研究结果相符，无论是在ace的转录水平还是表达水平上，其结果都可能是在虫体内产生过量的AChE，从而导致抗性的发生。李兵（2009）研究表明，家蚕Bm-ace2和野桑蚕（Bombyx mandarina）Bmm-ace2的突变是导致其对有机磷农药抗性差异的原因之一。刘海涛等（2010）也发现家蚕雌雄个体之间 Bm-ace2 基因的表达量不同，导致 AChE 的活性存在明显差异并最终使雌雄个体表现出不同的抗性。

许多学者都报道过抗性品系AChE的Vmax值升高的情况，一般认为AChE Vmax值的升高可能是过量表达的结果，而不是由于酶发生了质的变化所导致的。为了研究AChE量的变化对于抗性的作用， Fournier等（1992）通过P因子介导的种系转化法，建立了几种具有不同AChE基因型、能表达不同酶量的新果蝇品系。（1）Ace+/Ace+为能产生正常酶量的野生品系，该品系AChE由2个纯合的Ace拷贝编码；（2）pRA：Ace-/Ace-为经种系转化后存活的致死突变品系，其体内不含正常的Ace，Ace由pRA编码，酶活性为野生品系的20%-30%；

（3）Ace+/Ace-为含单个Ace拷贝的杂合品系，其酶量为野生种群的50%；（4）pRA：Ace+/Ace+为经pRA转化后的野生品系，其体内含两个纯合的Ace拷贝和pRA，其表达的酶量为野生品系的120%-130%。比较上述4个品系对有机磷杀虫剂马拉硫磷的敏感性，其敏感性水平由高到低依次为：pRA：Ace-/Ace-、Ace+/Ace-、Ace+/Ace+、pRA：Ace+/Ace+。随着各品系AChE活性的增加，其对有机磷的抗性越来越强。由此可见，AChE的量的增加与抗性是有一定的关系的，但在田间种群还没有发现这种情况。从理论上讲，AChE量的增加也不是没有可能的，但是由于AChE仅占昆虫头部蛋白质的1/2000，所以要想在田间种群中测出AChE量的差异是很不容易的。即使如此，AChE量的增加也不会太高，因为昆虫必须能承受这些多余

的AChE而不改变其基本的突触传导，所以AChE量的增加能引起多大程度的抗性，是否是害虫田间种群产生抗药性的一个机制还有待于进一步的研究

2.3 昆虫羧酸酯酶与抗药性的关系

羧酸酯酶（CarE, EC3.1.1.1）或者酯酶是能够水解羧酸酯的一类酶的集合术语，活性中心为ser-his-clu，属于丝氨酸酶。羧酸酯酶也称脂簇酯酶，是一组能催化水解羧酸酯生成羧酸和乙醇的同工酶，活性中心为Ser-his-glu三联体，属丝氨酸酶。宗静等（2000）报道了羧酸酯酶以水解蛋白和结合蛋白两种方式对杀虫药剂起解毒作用，具有广泛的底物特异性，可以水解羧酸酯键、酰胺键和硫酯键，能够与进入昆虫体内的有机磷杀虫剂快速结合，将杀虫剂在到达靶标作用位点之前阻隔或降解，使其无法发挥原有的杀伤效用。

许多研究表明，羧酸酯酶活性改变是昆虫（螨类）对有机磷和拟除虫菊酯类杀虫（螨）剂产生抗性的重要机理（陈达荣等，1990；韩启发，1995；张文吉等，1996；范志金等，1996；许雄山等，1999；孟和生等，2002）。梁沛等（2001）在研究小菜蛾对阿维菌素的抗性机制时指出，羧酸酯酶活性增强可能是其原因之一。赵颖等（1997）在比较了不同抗性品系棉蚜体内羧酸酯酶对α-乙酸萘酯和β-乙酸萘酯的水解活性后，发现三种不同水平抗性品系的羧酸酯酶比活力明显高于敏感品系。乔传令等（2000）对小菜蛾的抗药性研究也表明，小菜蛾对有机磷杀虫剂的抗药性与羧酸酯酶活性的增加有关。而在家蝇、丽蝇和印度谷螟等的研究中发现抗性品系羧酸酯酶活性下降的报道（Newcomb, 1997）。何林（2003）对朱砂叶螨的抗药性研究表明，朱砂叶螨对阿维菌素的抗性与羧酸酯酶的变化有关，而这种变化不仅涉及量变，而且还涉及羧酸酯酶的质变。

Newcomb等（1997）对丽蝇的分子生物学研究证实在羧酸酯酶活性部位存在G317D的突变，导致了羧酸酯酶对底物的水解活性降低而对杀虫剂的解毒活性升高，从而产生抗性。孙鲁娟等通过RT-PCR扩增的方法获得了有机磷抗、感棉蚜羧酸酯酶全长基因，对有机磷抗、感棉蚜羧酸酯酶基因测序结果进行序列分析表明，与敏感品系相比较，抗性品系羧酸酯酶基因有8处核苷酸发生突变，并且由此导致了4处氨基酸的取代，分别为T210M，N294K，G408D和S441F，但是何种氨基酸突变与棉蚜对有机磷抗性有关，拟通过表达的方法进一步明确。

Claudianos等（1999）发现羧酸酯酶基因Gly137突变为Asp，且突变体参与了拟除虫菊酯类杀虫剂的水解，而Trp251变为Leu后，其突变个体对顺式氯菊酯的代谢能力提高了10倍，对反式氯菊酯的代谢能力则提高了130倍。有证明淡色库蚊（Culex pipien）获得对有机磷杀虫剂的抗性是源于羧酸酯酶功能的改变，酯酶B1基因在110和224位点发生变异。得出的结论是昆虫羧酸酯酶224位点在杀虫剂的选择压力下改变其本身功能起着很重要的作用(Cui et al., 2007)。王东等（2008）通过对鳞翅目、膜翅目、双翅目和鞘翅目主要代表昆虫的多个羧酸酯酶氨基酸序列比对分析表明，不同昆虫羧酸酯酶之间在活性位点和近氨基端

序列保守性相对比较高。Pan等（2009）研究发现棉蚜马拉硫磷抗性品系羧酸酯酶活性显著高于其敏感品系，在对其抗性品系羧酸酯酶基因克隆发现了两个突变位点K14Q和N354D，且mRNA表达水平显著高于敏感品系。黄水金等（2010）利用 RT-PCR 技术和RACE方法获得了1个斜纹夜蛾 Spodoptera litura CarE基因的全长cDNA序列，命名为Slest2，并推测Slest2的过量表达可能是斜纹夜蛾对溴氰菊酯产生抗性的分子机制之一。这种推测为进一步研究夜蛾科昆虫的抗性机理奠定了基础。兰亦全等（2010）研究也表明羧酸酯酶活性的提高是甜菜夜蛾Spodoptera exigua对氰戊菊酯和顺式氯氰菊酯产生抗性的重要原因。刘海涛等（2011）推测家蚕对药剂产生抗性可能是因为其体内的羧酸酯酶（CarE）发生了突变，提高了对杀虫剂的水解能力。

前人研究表明，通过基因扩增，羧酸酯酶的活性上升可能对杀虫剂产生抗性。而活性部位的变构导致羧酸酯酶水解特性的改变同样也能使昆虫对杀虫剂产生抗性，这显示了代谢抗性机理的复杂性，因此，从分子水平上揭示羧酸酯酶基因扩增或变构与害虫抗药性形成的内在联系，在抗性监测和治理中具有重要意义。

3 总结

在分子水平上，有三种改变可导致昆虫对药剂产生抗性：①基因扩增；②突变；③过表达。

酯酶基因扩增是昆虫抗药性形成的主要机理。Devonshire（1982）对抗性和敏感的桃蚜Myzus persicae mRNA进行研究，证实抗性品系比敏感品系产生更多的编码E4酯酶的 mRNA，直到1987年，他利用分子生物学技术证明E4酯酶的增加是由于抗性桃蚜中编码E4酯酶的DNA拷贝数增加的缘故，从而在DNA水平上证实桃蚜对有机磷抗性是由于基因扩增的结果。Mouches（1990）利用分子克隆技术分离提取桃蚜B1酯酶的mRNA，再反转录成cDNA，并用这一cDNA为探针检测抗性和敏感品系基因组内编码 B1的拷贝，证实抗性品系的DNA拷贝数是敏感品系的250倍，从而证实酯酶B1基因扩增是抗性产生的原因，为世人展示了昆虫抗药性基因背景研究的新领域。Raymond et al.（1991）和Hemingway et.al（1998） 的研究表明非特异性酯酶α2ˊ和酯酶βˊ的基因扩增是致倦库蚊有机磷杀虫剂抗性的主要机理。乔传令等（2003）使用快速定量PCR（Light Cycler）荧光检测技术及时定量地检测出DNA 扩增的拷贝数，测定了上海致倦库蚊和PellRR致倦库蚊个体蚊虫酯酶α2ˊ和β2ˊ基因定量拷贝数，分析了表达水平和蚊虫种群抗性基因的分布及进化规律，并提供在个体蚊虫中这些基因表达水平的定量变化。

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