实验五酵母菌形态的观察和显微镜下细胞测量和计数

时间：2025-04-07

刘洋生物101 1002040120

一、实验目的

1、观察酵母菌的形态，掌握区分酵母菌死活细胞的染色方法。 2、掌握利用显微测微尺测量酵母菌大小的方法。

3、学习利用血球计数板测定微生物细胞数量的原理和方法。

二、实验原理

（一）酵母菌的形态观察

酵母菌是单细胞真核微生物，细胞呈圆形、椭圆形或柱状。酵母的细胞比细菌大得多，经过特殊的染色，在高倍镜下就可以观察到。酵母菌既可无性繁殖，又可有性繁殖。无性繁殖有芽殖和裂殖两种，芽殖又有单出、双出和多出之分。酵母菌的有性生殖一般能形成4~8个子囊孢子。在一定条件下，有的酵母菌进行芽殖后，长大的子细胞不与母细胞立即分离，并继续出芽，细胞成串排列，这种菌丝状的细胞串就称为假菌丝。假菌丝的各细胞间仅以狭小的面积相连，呈藕节状。

酵母菌的死活细胞可以通过美兰染色加以区分。美兰是一种无毒性染色剂，其氧化型为蓝色，还原型为无色。由于活细胞具有较强的还原能力，可以使美兰由蓝色的氧化型转变为无色的还原型。处于代谢旺盛的细胞还原美兰的能力强，细胞为无色，为代谢缓慢的老细胞、幼嫩芽体为浅蓝色，死细胞为深蓝色。

（二）显微镜下的细胞计数

本次实验采用血球计数法测定微生物细胞数。方法是将经过适当稀释的菌体细胞或孢子悬液，加到血球计数板的计数室内，在显微镜下逐格计数。因为计数室的容积是固定的（0.1mm3），所以可以将在显微镜下计得的菌数换算成单位体积试样中的菌数。

血球计数板使一块特制的载玻片，中部有H形的沟槽将中部分成上下两个计数室。计数室方格的边长为3mm，每个方格分为9个大方格，正中央的大方格被分为25个中方格，而每个中方格又被分为16个小方格。这样正中央的大方格总共分成400个小方格，每个小方格的体积为1/4000mm3（计数室的高度为0.1mm）。由此得到如下公式：

每毫升的菌数个 =

（三）显微镜下细胞大小的测量

用来测量微生物大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。镜台测微尺专用于校正目镜测微尺每格的长度，是中央部分可有精确等分线的载玻片。全长1mm，等分为100小格，每小格长10μm。目镜测微尺的刻度刻在一个略小于目镜内径的圆玻璃片上。将此测微尺放在目镜内观察物象时，可同时看见物象和测微尺，但是在配合不同放大倍数的物镜时，目镜测微尺每刻度间的长度会发生变化。所以，目镜测微尺不能直接用来测量微生物的大小，使用前必须利用镜台测微尺进行校正。

平均每个中方格内的菌数

×稀释倍数×4000×1000

三、实验材料

1、菌种：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、热带假丝酵母（Candida tropicalis） 2、染色剂：0.1%美兰染液

3、培养基：马铃薯葡萄糖培养基（PDA）

4、其他：血球计数板、镜台测微尺、目镜测微尺、载玻片、盖玻片、无菌水、洗瓶、擦镜纸、吸水纸、二甲苯、香柏油、接种用具

四、实验方法

（一）酵母菌的形态观察 1、芽殖观察

（1）制片：取一洁净载玻片，在其中央滴一滴美兰染液，用接种环取少量酿酒酵母菌苔在染液中涂匀。再用镊子取一盖玻片，以45°角与菌悬液接触后，轻轻盖在菌悬液上，避免产生气泡，用吸水纸吸干多余液体。

（2）观察：将水压片置于高倍镜下观察。观察芽殖和死、活细胞的颜色。30min之后，再次观察死、活细胞数是否发生了变化。

2、假菌丝的观察

（1）培养：将热带假丝酵母划线接种与马铃薯葡萄糖培养基平板表面，28℃培养2天，取出培养物，在无菌条件下，将一实现灭菌的无菌盖玻片轻轻压在划线处，继续培养2天。