实验五酵母菌形态的观察和显微镜下细胞测量和计数

刘洋生物101 1002040120

一、实验目的

1、观察酵母菌的形态，掌握区分酵母菌死活细胞的染色方法。 2、掌握利用显微测微尺测量酵母菌大小的方法。

3、学习利用血球计数板测定微生物细胞数量的原理和方法。

二、实验原理

（一）酵母菌的形态观察

酵母菌是单细胞真核微生物，细胞呈圆形、椭圆形或柱状。酵母的细胞比细菌大得多，经过特殊的染色，在高倍镜下就可以观察到。酵母菌既可无性繁殖，又可有性繁殖。无性繁殖有芽殖和裂殖两种，芽殖又有单出、双出和多出之分。酵母菌的有性生殖一般能形成4~8个子囊孢子。在一定条件下，有的酵母菌进行芽殖后，长大的子细胞不与母细胞立即分离，并继续出芽，细胞成串排列，这种菌丝状的细胞串就称为假菌丝。假菌丝的各细胞间仅以狭小的面积相连，呈藕节状。

酵母菌的死活细胞可以通过美兰染色加以区分。美兰是一种无毒性染色剂，其氧化型为蓝色，还原型为无色。由于活细胞具有较强的还原能力，可以使美兰由蓝色的氧化型转变为无色的还原型。处于代谢旺盛的细胞还原美兰的能力强，细胞为无色，为代谢缓慢的老细胞、幼嫩芽体为浅蓝色，死细胞为深蓝色。

（二）显微镜下的细胞计数

本次实验采用血球计数法测定微生物细胞数。方法是将经过适当稀释的菌体细胞或孢子悬液，加到血球计数板的计数室内，在显微镜下逐格计数。因为计数室的容积是固定的（0.1mm3），所以可以将在显微镜下计得的菌数换算成单位体积试样中的菌数。

血球计数板使一块特制的载玻片，中部有H形的沟槽将中部分成上下两个计数室。计数室方格的边长为3mm，每个方格分为9个大方格，正中央的大方格被分为25个中方格，而每个中方格又被分为16个小方格。这样正中央的大方格总共分成400个小方格，每个小方格的体积为1/4000mm3（计数室的高度为0.1mm）。由此得到如下公式：

每毫升的菌数 个 =

（三）显微镜下细胞大小的测量

用来测量微生物大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。镜台测微尺专用于校正目镜测微尺每格的长度，是中央部分可有精确等分线的载玻片。全长1mm，等分为100小格，每小格长10μm。目镜测微尺的刻度刻在一个略小于目镜内径的圆玻璃片上。将此测微尺放在目镜内观察物象时，可同时看见物象和测微尺，但是在配合不同放大倍数的物镜时，目镜测微尺每刻度间的长度会发生变化。所以，目镜测微尺不能直接用来测量微生物的大小，使用前必须利用镜台测微尺进行校正。

平均每个中方格内的菌数

×稀释倍数×4000×1000

三、实验材料

1、菌种：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、热带假丝酵母（Candida tropicalis） 2、染色剂：0.1%美兰染液

3、培养基：马铃薯葡萄糖培养基（PDA）

4、其他：血球计数板、镜台测微尺、目镜测微尺、载玻片、盖玻片、无菌水、洗瓶、擦镜纸、吸水纸、二甲苯、香柏油、接种用具

四、实验方法

（一）酵母菌的形态观察 1、芽殖观察

（1）制片：取一洁净载玻片，在其中央滴一滴美兰染液，用接种环取少量酿酒酵母菌苔在染液中涂匀。再用镊子取一盖玻片，以45°角与菌悬液接触后，轻轻盖在菌悬液上，避免产生气泡，用吸水纸吸干多余液体。

（2）观察：将水压片置于高倍镜下观察。观察芽殖和死、活细胞的颜色。30min之后，再次观察死、活细胞数是否发生了变化。

2、假菌丝的观察

（1）培养：将热带假丝酵母划线接种与马铃薯葡萄糖培养基平板表面，28℃培养2天，取出培养物，在无菌条件下，将一实现灭菌的无菌盖玻片轻轻压在划线处，继续培养2天。

（2）观察：打开培养皿盖，与高倍镜下直接观察 3、酿酒酵母菌子囊孢子的观察

于高倍镜下观察子囊孢子装片，注意子囊孢子的数目和形状。 （二）显微镜下的细胞计数

1、制备菌悬液：用无菌接种环在酿酒酵母菌斜面上刮下适量菌苔，将菌苔分散在盛有5ml无菌水的试管中，充分振荡。

2、加菌液：先用擦镜纸将血球计数室擦净，用无菌滴管取着凉酿酒酵母菌悬液滴入上下两个计数室内，盖上盖玻片，不能有气泡，否则重做。

3、计数：现在显微镜下找到计数室，在正中央的大方格中沿对角线取9个中方格，计数每个中方格中的菌数，填入下表，并计算单位体积的菌数（个/ml）。

（三）显微镜下细胞大小的测量 1、校正目镜测微尺

（1）安装目镜测微尺：取出目镜，旋开透镜螺旋，将目镜测微尺刻度朝下放入目镜筒，然后旋好螺旋，插入显微镜筒。

（2）放置镜台测微尺：将镜台测微尺放在载物台上，使刻度面朝上。

（3）校正：在显微镜下观察，调准焦距，当看清镜台测微尺后，转动目镜，使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度相平行，然后移动推动器，使目镜测微尺和镜台测微尺的某一区间的两条刻度线完全重合，在数出两条重合先之间各自所占的格数，根据公式得到校正后的目镜测微尺每小格的长度。

目镜测微尺每小格的长度 =

两条重合线间镜台测微尺的格数×10

两条重合线间目镜测微尺的格数

2、制酿酒酵母水压片：取一洁净载玻片，在中央滴一滴上面制备的菌悬液，小心盖上盖玻片，用吸水纸将多余的液体吸干，不能产生气泡。

3、测量酿酒酵母菌体大小：将酿酒酵母水压片放在载物台上，在显微镜下看清菌体后，转动目镜测量酵母细胞菌体的直径，共需测量10个细胞。

五、实验结果及分析

（一）酵母菌的形态观察

1、美兰染色后，观察到视野中细胞呈圆形或椭圆形，大部分呈白色，少部分呈蓝色。可见芽殖，较大

的母体细胞旁边有一较小的芽体，母体细胞白色，芽体浅蓝色。而在子囊孢子的观察中，可见四个呈菱形的子囊孢子靠在一起，相互之间以及孢子于环境之间都有透明的子囊壁隔开。芽殖和子囊孢子如下图1所示。

2、假菌丝的观察

（二）显微镜下的细胞计数 将计得菌数填入下表1。

表1 酿酒酵母的血球计数板计数

格数 数目

1 5

2 6

3 6

4 5

5 7

6 6

7 5

8 3

9 4

平均数 5.375

根据公式，计算所得单位体积的菌数如下：

每毫升的菌数 个 =

=

平均每个中方格内的菌数

×稀释倍数×4000×1000

5.375

×1×4000×1000（个）=1343750（个） 16

（三）显微镜下细胞大小的测量 1、目镜测微尺的校正结果

表2 目镜测微尺刻度的校正

物镜 高倍镜

2、测量结果

表3 酿酒酵母细胞大小的测量

物镜倍数 40

目镜测微尺格数

20

镜台测微尺格数

5

目镜测微尺每格代表的长（μm）

2.5

3、班级数据汇总：

3.1酿酒酵母的血球计数板计数

由上表可知，酿酒酵母细胞平均大小为4.4×3.6μm，而细胞的大小范围是（3.2~5.2）×（1.8~4.3）μm。

3.2酿酒酵母细胞大小的测量

描述性统计结果：

六、思考题

1. 用美兰染色时，如何在光学显微镜下区分酵母细胞代谢活性的强弱？

2. 用光学显微镜观察酵母菌体时，其在制片和染色方面与细菌有何差别？ 3. 为什么说热带假丝酵母的菌丝是假菌丝？ 七、总结

1、制备待计数菌悬液时，为避免无菌水中菌体密度过大影响观察，接种环刮去培养基表面少量菌苔即可。但问题在于对于实验室中未知菌落数量大小的观察，是否有一个统一公认的方法，否则每个人取量不一致，那么实验的可重复性非常低，对于科研论文等则缺乏客观性，也因此希望老师能够明示。

2、计数时需要充分摇匀后计数，否则对于同一批样品因前后取样时间差异，也会导致两个数据间存在较大差异。从而造成结果上的不准确。