基因扩增检验标本的处理保存及核酸提取方法

基因扩增检验标本的处理

保存及核酸提取方法

江西省临床检验中心

基因扩增检验标本的处理保存及核酸提取方法

应用聚合酶链反应（PCR）技

术测定临床标本中的病原体核

酸成分，是一种高度敏感，且

最为直接的检测手段。由于临

床标本中含有蛋白质、脂类等

物质，可干扰PCR反应，故在

做PCR反应前必须进行核酸提

取。

基因扩增检验标本的处理保存及核酸提取方法

经典的核酸提取方法通常是加去

污剂（SDS等）裂解细胞，经蛋

白酶处理、有机溶剂提取及乙醇

沉淀等步骤。

基因扩增检验标本的处理保存及核酸提取方法

由于样本的处理及保存对DNA

和RNA（尤其是RNA）的影响

较大，因此在核酸测定时标本的

处理及适当保存对测定结果的准

确有效非常重要。

基因扩增检验标本的处理保存及核酸提取方法

临床常见的标本有血清（浆）、

全血、分泌物、棉拭子、脓液、

体液、新鲜组织、石蜡切片等，

这些临床标本的处理和保存方法

各有不同。

基因扩增检验标本的处理保存及核酸提取方法

临床标本的处理

基因扩增检验标本的处理保存及核酸提取方法

血清（浆）标本

一些病原体，如乙肝病毒

（HBV）、丙肝病毒（HCV）、

人类免疫缺陷病毒（HIV）等的PCR检测常采用血清或血浆标

本。

基因扩增检验标本的处理保存及核酸提取方法

HBV：标本通常由医护人员采

集，应注意避免溶血，如为血浆

标本注意抗凝剂的选择，一般

用EDTA-Na2或枸橼酸纳，不可

使用肝素。标本为全血时，及时

分离出血浆，提取病毒DNA进

行检测。

基因扩增检验标本的处理保存及核酸提取方法

HCV：检测RNA病毒。由于RNA极

易降解，标本的制备和保存方式往

往可以影响测定结果。若用血浆标

本，应使用EDTA抗凝。严禁使用

肝素，因其对PCR扩增有抑制作用,

且无法在核酸提取过程中去除。抗

凝后6小时内分离血浆。如用血清标

本，则应尽快（2小时内）分离血清

进行检测，或-20oC保存。

基因扩增检验标本的处理保存及核酸提取方法

全血标本

通常用来提取外周血单个核细胞核

酸：如基因组DNA、线粒体DNA、总RNA等。

抗凝剂：一般使用EDTA-Na2、枸橼

酸纳，不使用肝素。

基因扩增检验标本的处理保存及核酸提取方法

前处理：

1）加适量的红细胞裂解液（破膜液），

裂解全血中的红细胞。

2）再加适量的细胞核裂液（破核液），

裂解白细胞中的细胞核，使核内DNA 释

放出来。

3）然后再加SDS（十二烷基硫酸钠）

等去污剂，溶解脂蛋白，解聚核蛋白。

基因扩增检验标本的处理保存及核酸提取方法

SDS可与蛋白质结成复合物，

使蛋白质变性沉淀，但SDS在以

后的核酸提取过程中必须除

去。

基因扩增检验标本的处理保存及核酸提取方法

痰标本

痰属于分泌物，临床上常用作结核

杆菌DNA测定样本，由于痰标本中

含大量粘蛋白和杂质，故在核酸提

取时，一定要对标本进行前处理，

即用4%NaOH液化，去除粘蛋白，

然后用煮沸或蛋白酶、酚/氯仿等经

典法提取DNA。

基因扩增检验标本的处理保存及核酸提取方法

具体方法：

用无菌平皿取患者肺深部咳出的痰液1-3ml，

加入4倍体积，摇匀，室温下放置30

分钟左右液化

取1.5ml EP管，加0.5ml 液化痰液，再加0.5ml 4%NaOH室温放10分钟

基因扩增检验标本的处理保存及核酸提取方法

12000 rpm，离心15分钟

弃上12000rpm清，加离无菌生心5分理钟盐水1 ml ，

弃上清，沉淀物用于DNA提取

，混匀

基因扩增检验标本的处理保存及核酸提取方法

棉拭子

用PCR方法检测性病病原体时（衣

原体、支原体、淋球菌、梅毒螺旋

体、人乳头状瘤病毒等），临床标

本一般为棉拭子。标本取材是关

键，衣原体等病原体感染上皮细

胞，因此取材一定要取到细胞。