mRNA差异显示技术

1.概 述

mRNA差异显示技术（mRNA differetial display）是一种快速有效的克隆差异性表达基因的方法。 方法建立：1992年 Liang P和Pardee首次应用DD技术对比人类乳腺癌细胞与正常细胞所表达的mRNA，以此来克隆癌细胞所特有的基因

目前已应用于个各领域：

– 农业、植物 – 动物 – 医学

胚胎发育 遗传病 药物 肿瘤

2.mRNA差异显示原理

是分离差异表达基因的一个重要方法。人类大约含有三万个不同的基因。在不同的单个细胞中只有10％的基因处于表达状态。

生物体在不同的生理，病理状态下，基因的表达水平不同。

生命过程中选择性表达的基因主要有：发育与分化、体内平衡、对攻击的应答、细胞周期调节、老化和程序性细胞死亡等。

差异显示获得的只是某个基因的片段，而不是直接获得全长cDNA克隆。

3.基本程序

– – – –

选择表型特性差异显著对象 展示mRNA的差异 基因差异

克隆与表型差异高度相关的新基因

4.技术

基本技术

– 逆转录（ RT ）

– 聚合酶链反应（PCR） – 凝胶电泳

锚定引物 T12-MN，含有12个T可以结合于mRNA 3`端 poly（A）尾，M为A、C、G 3种碱基之一，N为A、T、C、G 4种碱基之一。

荧光锚定引物 ，引物5`端加入T7 RNA多聚酶启动子并带有荧光分子

5.RT-PCR

----------- AAAAAAAAAA –3` mRNA

------------XAAAAAAAAAAA–3` 1/3 mRNA MTTTTTTTTTTTT（12T） Prime

---------YXAAAAAAAAAAAAA –3` 1/12 mRNA NMTTTTTTTTTTTT（12T）Anchor Prime

荧光锚定引物：

NMTTTTTTTTTTTT-T7 RNA多聚酶启动子-荧光分子 （Genomyx company）

因此共有12种锚定引物 同位素标记锚定引物

随机引物 （Arbitrary Prime）

可以随机地与cDNA不同位置多个位点结合，扩增出不同长度的cDNA片段混合物。 共20种随机引物，随机引物-M13 随机和锚定引物的多种组合可以展示10000-15000种mRNA

6.技术路线

mRNA 差异显示技术 The fluoroDD System Builds on the HIEROGLYPH system

– TMR-labeled anchored primers – Increased primer concentrations – Increased dNTP concentrations – Optimized DD-PCR protocol – TMR-labeled M.W. markers

Genomyx Research into Improving the Process of Differential Display Optimize gel electrophoresis Optimize PCR Optimize primers Streamline downstream analysis

HIEROGLYPH mRNA Profile Kit Primers Advantages of HIEROGLYPH DD Primers Genomyx LRS

genomyxSC and fluorescent labeling

Band Recovery with Virtual Grid and Excision Workstation

7.差异显示的优越性

仅需少量的总RNA（0.2-0.02ug，200个 细胞中提取的总RNA） PCR放大作用，灵敏度高 同时分析多组样品

实验周期短，8天可以完成

最突出的优点是实验过程中可步步验证

– – – – – –

RNA提取 RT-PCR

切胶后再扩增 克隆 测序

Northern验证

–

RT-PCR

8.存在的问题和对策

假阳性率高（50-70%）

– 提取RNA时，防止DNA的污染（DNA酶充分消化） – 切胶时选择差异显著的条带，选择或有或无的条带 – 基因克隆时阳性菌落的挑选 – PCR扩增中交叉污染 – Reverse Northern确认

扩增片段短

– 扩增片段较短（〈500bp），信息少

– RACE（Rapid Amplication of cDNA Ends) – 基因文库得到cDNA全长

骨科

– Boden 发现LMP-1基因，并用于基因治疗 溃疡性结肠炎

– Zuo发现溃结黏膜25个表达基因

9.医学中的应用

肿瘤学研究方面

是一个重要的手段。 如胃癌、肺癌、乳腺癌、食管癌、结肠癌等，并取得了令人鼓舞的研究进展。Samant等应用差异显示技术克隆和鉴定新的乳腺癌转移抑制基因（BRMS1），Chung等在小细胞肺癌中克隆出新的跨膜GTPase基因。在国内Chen等分离鉴定2个与食管癌相关的基因，SPRR3和Transglutaminase-3。

胃癌组织中，Yoshikawa等用差异显示技术分离和鉴定了2个新的基因，与正常组织比较发现它们在人胃癌中下调。Shiozaki等报道一个新的胃特异性基因CA11，它在胃癌细胞中下调，通过基因文库的鉴定

胃癌及癌前病变差异显示研究

mRNA差异显示技术(mRNA differential display PCR, mRNA DD-PCR)是由Peng Liang等人在1992年建立的筛选基因差异表达的有效方法。它是将mRNA逆转录技术和PCR技术相结合的一种RNA指纹图谱技术。每一种组织细胞(包括同一组织细胞经过不同的处理)都有其特异表达的不同于其他组织细胞的基因谱，即特异的RNA指纹图谱。 1．原理

差异基因表达是细胞分化的基础。正是这些基因在细胞中的特异表达与否，决定了生命历程中细胞的发育和分化、细胞周期的调节、细胞衰老和死亡等。mRNA DD-PCR技术正是对组织特异性表达基因进行分离的一种快速而行之有效的方法。不

同的组织/细胞或遗传背景相同的同一组织/细胞经过不同的处理后，提取各自的总RNA，进行mRNA的逆转录合成 cDNA。进行逆转录时3'端引物采用oligo(dT)l2MN，其中M为A、C、G中的任何一种，N为A、C、G或T中的任何一种，所以共有12种oligo(dT)l2MN引物。其申M称为锚定引物，起增大引物Tm值的作用。N称为分类碱基，对逆转录进行 …… 此处隐藏：1444字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……