基因功能分析的基本策略

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# 依赖于对模式生物的研究

#有力工具 基因敲除技术、转基因动物模型、 基因转染细胞模型、 RNA干涉技术

内容概要

第一节 转基因技术用于基因功能分析 第二节 基因打靶技术用于基因功能分析 第三节 反义RNA和RNAi抑制或沉默基

因表达

第一节 转基因技术转基因技术概念 转基因技术是指将外源基因导入受体细胞染色体上， 使转基因在受体细胞内表达并发挥其功能的基因操作方 法。 利用转基因技术可以制备转基因生物或基因转染细 胞。通常所指的转基因生物是指将外源基因导入受精卵 细胞或胚胎干细胞中，使外源基因通过随机重组插入到 受体细胞的染色体上，并随细胞的分裂而将外源基因遗 传给后代。

第一节 转基因技术

一、转基因动物二、基因转染细胞模型

一、转基因动物 (transgenic animal)(一)概念应用转基因技术培育出的携带外源基因并能稳定遗传的动物。

(二)基本过程1、转基因载体的构建； 2、将转基因载体导入受精卵细胞或胚胎干细胞； 3、将转基因受精卵或胚胎干细胞植入假孕小鼠子宫内； 4、对转基因动物进行鉴定。

启动子转基因载体

结构基因

报告基因注射

受精

增强子全能性细胞

转基因小鼠

植入

Southern blot 假孕小鼠

RT-PCR Western blot

后代

(三)转基因动物应用1、通过转基因动物来研究特定基因在组织中特异表达或表达 的时相；

2、在活体内研究或发现基因的新功能； 3、可用于只在胚胎期才表达的基因结构和功能研究； 4、建立研究外源基因表达、调控的动物模型； 5、遗传性疾病的研究； 6、建立人类疾病的动物模型，为人类的基因治疗提供依据； 7、动物新品种的培育； 8、基因工程产品的制备；

(四)转基因技术存在的问题1、不能将外源基因定向地插入受精卵细胞染色体的特 定部位； 2、外源基因随机整合可能引起插入突变，破坏宿主基

因组功能；3、外源基因随机整合在宿主染色体上的拷贝数不同， 可能出现不同表现型；

4、整合的外源基因遗传丢失而导致转基因动物症状的不稳定遗传。

二、稳定转染细胞稳定转染细胞是一种最常用的细胞水平的转基因模 型，外源基因通过转基因过程插入到细胞染色体中，使

外源基因可以作为细胞染色体的一部分得以在细胞中稳定表达。 稳定转染细胞基本过程：

1、真核重组表达质粒的构建：将外源基因和真核表达质粒连接构建成重组质粒； 2、在原核细胞中复制扩增和克隆化真核重组表达质粒；

3、将重组表达质粒转染哺乳动物细胞；4、重组质粒转染细胞的克隆化筛选、保存； 5、转染细胞

表达目的蛋白、提取、鉴定。

内容概要

第一节 转基因技术用于基因功能分析 第二节 基因打靶技术用于基因功能分析 第三节 反义RNA和RNAi抑制或沉默基

因表达

第二节

基因打靶技术

基因打靶(gene targeting)是通过同源重组定向地

从细胞染色体上移除或移入基因的过程。一般将定向移除基因的过程称为基因敲除技术(gene knock-out),定 向移入基因的过程称为基因敲入(gene knock-in );

通过同源重组定向地在活体内剔除特定基因的动物称为基因敲除动物。目前基因敲除小鼠是应用最广泛的动物模型 之一。

基因敲除载体的构建

基因敲除小鼠建 立流程示意图(1)

基因敲除小鼠建 立流程示意图(2)

一、基因敲除技术的基本过程：

1、打靶载体的构建：一般包括三次DNA体外重组 ①、将待剔除基因作为目的基因克隆到特定克隆载体上；

②、将带有目的基因的重组载体作为克隆载体，利用合适的内切酶将目的基因片段的大部分切除，使目的基因 活性足以丧失，然后以此线性载体作为克隆载体，将一 个阳性筛选标志基因插入连接到目的基因的中段；例如； Neor基因：使细胞具有抵抗新霉素(G418)能力。