相关的转化培养方法总汇

转化培养方法总汇

二、相关的转化培养方法总汇

方法一：

昆虫细胞转染：

1．Sf9细胞计数，取6孔板中的两孔，每孔加入9×10 5个细胞(其中一孔设为正常对照)，并以全培培养至少1小时，使细胞贴壁。

2．准备重组质粒和细胞转染试剂的混合物：

a.溶解1μg纯化重组杆状病毒重组质粒于100μl 无添加成分的Grace’s Medium。 b.转染试剂充分摇匀后取6μl加入100μl 无添加成分的Grace’s Medium，混匀。 c.将上述稀释好的质粒及稀释好的转染剂混匀，室温孵育20min。

3．重组质粒与转染剂混合液孵育的同时，以2ml无添加成分的Grace’s Medium洗涤待转染的一孔细胞并弃去洗液。

4．取0.8ml无添加成分的Grace’s Medium加入质粒与转染剂的混合液中，轻轻混匀后，总体积约为1ml。加入上步洗涤后的细胞孔中，27℃继续培养5h。

5．移除质粒、转染剂混合物，加入2ml全培。27℃湿盒孵育，直到病变现象产生。

二、病毒贮液的制备：

1.病毒感染晚期（正常24-72h）可见细胞停止生长、黏附，呈颗粒状外观。即收集含病毒的培养上清，500g离心5min，去除细胞和碎片。

2.上清即为P1病毒贮液，移入新的离心管中4℃避光保存。长期保存分装冻存于-80℃。

3.病毒贮液的扩增，按以下公式进行所需病毒P1贮液的量：

感染所需病毒贮液量(ml)=[MOI(pfu/cell) ×细胞数÷病毒贮液效价(pfu/ml)]

注：若不进行病毒空斑测定，P1贮液效价按照1×10 6到1×10 7计。

4.扩增P1液制备P2病毒贮液方法如下：

a.转染当天，取2×106个细胞/孔加入六孔板中，贴壁生长至少1h。

b.每孔加入适量的P1贮液，27℃湿盒孵育48h。

c.根均细胞病变情况（约48h后）收集各孔中的病毒上清液，500g离心5min取上清，即为P2病毒贮液。4℃避光保存。长期保存分装冻存于-80℃。

d.制备了高效价的P2液后，按上述方法扩增P3贮液，用于高效表达。

方法二：

1、病毒扩增

大量培养Sf9细胞，待细胞长成单层处于对数生长期时用于病毒感染。具体操作包括：吸弃培养基，接种病毒，使病毒感染复数(MOI)小于1。室温吸附1h后除去病毒接种物，换以新鲜培养基，27℃培养48～72h，收集上清待用。

2、表达产物的检测

病毒定量感染和样品制备 接种2×106个处于对数生长期的Sf9细胞至25cm2细胞培养瓶中，使用高滴度病毒原液，病毒滴度(PFU/mL)至少为1×108有效病毒粒子/mL，且病毒感染复数(MOI)控制在5～10之间。病毒接种细胞吸附1h后，弃病毒液，换以新鲜的培养基27℃培养72h后，移弃培养基，预冷的PBS(pH7.4)缓冲液洗涤细胞数次。除尽残留液体，再加入500μL预冷的细胞裂解液(含有1×Protease inhibitor cocktail)，用橡皮刮刮下细胞收集至eppendorf管内，置冰浴裂解45min，每50μL细胞裂解物分装至一个eppendorf管中，置于-20℃或者-80℃贮存备用或直接用于表达情况分析。

其它的不详细的方法

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1.草地贪夜蛾( S podoptera f rugierda) Sf21 细胞系, E. coliDH5α,AcMNPV 1A 株,质粒pHZ402 ,pAcDZ1 均为本实验室保存,转座子构建质粒pMod2 购自Epicent re. Sf21 细胞用TNM2FH 培养液加10 %胎牛血清培养. 细菌、质粒、基因操作参照文献7 .

Sf21 细胞悬浮培养至约1 ×106 个时(参照文献8 ) ,按MOI = 1 pfu/ cell 接种AcMNPV ,48 h 后,细胞悬液以5 000 r/ min 离心15 min ,取上清液. 上清液再以17 000 r/ min 4 ℃离心30 min ,用450μL 无菌水悬浮沉淀. 加入50μL 10 %的SDS ,56 ℃30 min ;加入蛋白酶K至100μg/ mL , 再次56 ℃30 min. 用酚/ 氯仿法抽提病毒基因组DNA ,乙醇沉淀DNA. 以50μL 无菌水溶解DNA ,4 ℃放置待用

细胞转染

5 ×105 个Sf21 细胞27 ℃静置培养2 h ,使细胞贴壁. 取5μL 上述转座反应液,用Cellfectin ( Invit ro2gen) 转染细胞,方法参见产品说明书. 转染后细胞27 ℃培养,Nikon HFX倒置荧光显微镜观察. 转染后72h ,收集细胞的培养上清液,作为重组病毒库的原代病毒液,4 ℃保存备用.

2.参照Summers 的方法,重组转移载体pBacPAK2CE2 DNA 2μg 与线性化的病毒Bm2BacPAK6 DNA 500ng在脂质体的介导下共转染BmN 细胞(具体操作按Dosper 脂质体产品说明书进行) 。约4～7 d 细胞出现病毒感染症状,收集病毒液进行空斑筛选,挑斑于铺有单层BmN 细胞的96 孔板中,27 ℃条件下培养3～4 d ,用X2gal 挑选出白斑,再进行3 轮筛选以纯化重组病毒。

3.杆状病毒转移载体质粒PACSecG2T、sf9 细胞购自GIBCO BRL 公司,TNM2FH 昆虫细胞培养基、无血清昆虫细胞培养基、核多角体野病毒(ACNPV) DNA、磷酸钙共转染试剂合购自BD pharmingen 公司, 重组病毒的构建[2～4 ] 含有插入片段的重组质粒经纯化后与线性化的Baculo GOLDTM DNA ,采用磷酸钙介导的细胞转染法,经有限稀释法和空斑实验筛选重组病毒,具体操作见BD Pharmingen 公司手册,

表达产物的获得 将感染复数MOI 为7～10 的病毒加入处于对数生长期的sf9 细胞中,室温吸附2 h 后,用无血清培养基清洗2 次,再加入3 mL 新鲜的无血清培养基,28 ℃培养72～9 6 h ,收集细胞培养上清液。 重组蛋白的表达和特异性 以含病毒的上清液接种对数生长期的sf9 细胞,2 8 ℃培养3 d ,收获细胞,超声破碎,离心收集上清液电泳观察结果

4.选用美国Pharmigen 公司的磷酸钙共转染法将重组质粒导入Sf9 细胞,27 ℃培养5 d后,收获上清。将转染上清经噬斑 …… 此处隐藏：4804字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……