金纳多注射液对大鼠局灶性脑缺血-再灌注后神经元凋亡及caspase-8蛋白表达的影

脑缺血治疗的关键是减轻脑缺血半暗带区的神经元凋亡。细胞内有一套精细复杂的信号系统在调控着凋亡过程。死亡受体(death receptor,DR)通路是细胞凋亡的主要信号转导通路,以caspase-8蛋白的激活为特征。近年来银杏叶制剂被临床广泛用于缺血性脑血管病的治疗,银杏叶制剂为复合制剂.其主要有效成分为24%类黄酮和6%萜内酯。

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中国现代神经疾病杂志 2 0 0 8年 2月第 8卷第 1期 C i hnJ

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基础研究

金纳多注射液对大鼠局灶性脑缺血 .注后再灌神经元凋亡及 csae8蛋白表达的影响 aps.宋利春张鸿贾春红刘艳艳

脑缺血治疗的关键是减轻脑缺血半暗带区的神经元凋亡…。细胞内有一套精细复杂的信号系统在调控着凋亡过程。死亡受体 (et ee tr D d a rcpo。 R) h

鼠以 1%水合氯醛 ( 5 g k ) 0 3 0m/ g腹腔注射麻醉，卧仰位固定，颈部正中切口，离并显露左侧颈总动脉分及颈内、动脉，扎左侧颈总动脉及颈外动脉根外结部，于颈总动脉近分叉处剪一小口插入尼龙线 (长

通路是细胞凋亡的主要信号转导通路， csae8以 ap s一蛋白的激活为特征[。近年来银杏叶制剂被 I 2 3临床广泛用于缺血性脑血管病的治疗，银杏叶制剂为复合制剂，其主要有效成分为 2%类黄酮和 6 4%萜内酯。

5 m, 0m直径 02 m)距起始端 1 m处作标记， . m, 3 8m插入长度为 ( 8 040 0 m并感到有轻微阻力时 1. . ) m 0 -5停止，紧并固定插线，扎缝合皮肤，阻断血流 1 h后，

本实验旨在观察银杏叶萃取物金纳多注射液对大鼠局灶性脑缺血一灌注后神经元凋亡数目以及再

拔线实现再灌注。假手术组大鼠除不插线外，余其步骤均与缺血组和治疗组相同。鼠在缺血一灌注大再 2 4h后经 1%水合氯醛 (0 / g深度麻醉， 0 6 0mgk )迅速打开胸腔，露心脏，开右心房，显剪于心尖部剪开左心室，管至主动脉，插快速注入 10ml理盐水冲 0生洗，而后再以 4%多聚甲醛灌注固定，断头切取全脑， 4以%多聚甲醛固定 2 ; 4h常规脱水、透明，至石

cs ae8蛋白表达水平的影响，明确银杏叶萃取 ap s一以物的脑保护作用机制。材料与方法一

、

材料

1试剂与药品 .

一抗为兔抗大鼠 c sae8IG ap s一 g

蜡包埋，连续冠状切片，织切片层厚为 6组

m。2细胞凋亡检测 (U E . T N L法 )于脑组织切片

抗体 (: 6 ) 1 1 0,二抗为生物素标记的山羊抗兔 IG g抗体 (不稀释 )细胞凋亡试剂盒以及 csae8免疫。 ap s.

上滴加 3%过氧化氢，室温下处理 1 n蒸馏水冲 0mi,洗 2 i×3, m n次加入 01 o/ r缓冲液 ( B,: . m lLT i 0 s T S1 2 o新鲜稀释的蛋白酶 3 o) 7℃消化 1 n加入标记 0mi,液 ( 0/ )7 2 l片 3℃孵育 2h 01 o LT i缓冲液 ,.0m l r/ s

组织化学试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。金纳多注射液由德国威玛制药厂生产。 2 .实验动物及分组 1 2—1 6周龄健康雄性清洁级 Wi a大鼠 2 sr t 0只。质量 2 0~3 0g由中国体 5 0,医科大学实验动物中心提供。按随机抓取方法分为假手术组 ( 5只 )缺血一灌注组 (血组，、再缺 5只 )金和

冲洗 2mi×3次，封闭液 (0I/ )温下封闭 n加 5片室 - d 3 i,封闭液 (:0 )释生物素化抗地高辛抗 0m n用 1 10稀体 (O/ )后加至标本片上，7℃反应 3 i。 5 l片， 3 0m n01 o/ s冲液冲洗 2m n . 0m lL缓 i×3次，加入链霉亲和素一生物素化过氧化物酶复合物 ( A C)7o反 S B 3 C应 3 i。.0m lLT i缓冲液冲洗 5m n× 0m n 01 o r/ s i 4次； 二氨基联苯胺 ( A )色， D B显蒸馏水冲洗，木素轻度苏复染。 . lL s冲液冲洗，蒸馏水冲洗， 01 mo 缓 0/脱水、至透明，片。于光学显微镜下观察细胞凋亡情封

纳多治疗组 (0只)金纳多治疗组依剂量不同又分 1。为小剂量组 (0mgk, 2 / g 5只 )和大剂量组 (0mg k, 4 / g

5只 )分别于缺血前 3 i, 0m n及缺血后 1h再灌注的 同时予以金纳多注射液 2 / g及 4 / g进行 0mg k 0mgk腹腔内注射。二、验方法实

1动物模型的制备及标本采集 .

大鼠大脑中动

况.以细胞核中出现棕黄色颗粒者为阳性细胞。 3免疫组织化学染色切片滴加 3 .%过氧化氢，室温下处

理 1 i,馏水冲洗 3mi×3次， 0m n蒸 n微

脉缺血模型的制备参照改良 N gsw线拴法[。 aaa a 3大]作者单位：10 4沈阳，国医科大学附属盛京医院神经内科 l 00中 (利春，鸿，春红 )天津市天和医院神经内科 (艳艳 )宋张贾；刘 通讯作者：利春 ( malsnl@c 2 . r)宋 E i:ogc mu h o cn

波修复抗原，加 5滴%牛血清白蛋白 ( S封闭液， B A) 室温下反应 2 i, 0m n滴加一抗 3 7℃孵育 10mi, 2 n磷