海洋微生物次级代谢产物的分离纯化

海洋微生物次级代谢产物的分离纯化方法等

海洋微生物次级代谢产物分离 纯化的一般流程与应用举例姚元江 黄思洋 李艳君 臧兴禹

海洋微生物次级代谢产物的分离纯化方法等

背景 海洋是个大宝库。 微生物主要来源于深海，环境特殊，有着 自己独特的代谢方式，从而产生结构新颖、 活性显著的代谢产物。 这些产物可作为新药药源。

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分离与纯化的一般工艺过程发酵液发酵液的 预处理与 固液分离 胞 外 产 物沉淀、萃 取、超滤 加热，调 pH,絮凝

预处理

细胞分离细胞破碎 浓缩、去热 原、干燥

细胞碎片分离初步纯化

成品加工 高度纯化

色谱分离 结晶

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与已知一般微生物次级代谢产物分 离纯化的主要区别 样品来源：生物样品及供培养的海水分别 采自深海。 在发酵之前要对微生物的活性进行摸索性 的筛选。(分为四步)

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一、微生物分离筛选 称取一定量的生物样品,在无菌状态下加入 1 10 100 到适量的灭菌海水中, 振荡混匀，再分别稀 释10,100倍共制成3个浓度梯度的样品； 各取0.2 mL涂布于固体培养基，每个梯度 涂布3个平板。将海水样品取1 mL同上操作， 28°C 培养，每天观察并挑出单个生成菌落 进行再纯化后接种于固体斜面培养基。

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微生物分离筛选

发酵培养及样品制备活性筛选

静置培养

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氯仿萃取脱脂去除杂蛋白。 超滤浓缩。

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分离与纯化的一般工艺过程发酵液发酵液的 预处理与 固液分离 胞 外 产 物沉淀、萃 氯仿萃取脱脂去除杂蛋白。 取、超滤 超滤浓缩。 加热，调 pH,絮凝

预处理

细胞分离细胞破碎 浓缩、去热 原、干燥

细胞碎片分离初步纯化

成品加工 高度纯化

色谱分离 结晶

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氯仿萃取脱脂去除杂蛋白。 超滤浓缩。 将次级代谢产物进行离子交换柱层析分离后，盐 洗脱峰为活性峰。 收集活性峰脱盐浓缩后上样于凝胶过滤层析柱， 收集活性峰透析浓缩后作为纯化样品使用。 整个纯化过程中阳离子交换柱层析纯化效果 最为明显,去除了大部分杂蛋白，最终代谢 产物纯度提高。

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目标产物的活力测定将纯化后的样品配置成溶液,用SDS-page电泳测定代谢产物的纯度。

举例说明：芽胞杆菌次级代谢产物的分离纯化的操作流程为例。

发酵培养 离心

菌体丙酮浸泡2 h提取 悬蒸去除丙酮 与发酵液上清合并

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D312大孔吸附树脂吸附后乙酸乙酯 洗脱 粗提物用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和 甲醇分级固液萃取

硅胶GF254薄层板展开进行UV全长扫描，255 nm附近有最 大吸收峰 进一步通过Sephadex LH20凝胶层析 纯化样品

用高效液相对其纯度进行分析

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总结

基于分析化学、材料化学等学科的发展和微生 物代谢产物物质结构的研究,目前用于海洋微 生物次级代谢产物的分离纯化方法已

经有很多, 溶剂萃取法、离子交换分离法、吸附分析法、 沉淀分离法、化学萃取法、超临界流体萃取法 等在实验中的运用已比较常见。而由于海洋微 生物代谢产物的结构特点和理化性质，溶剂萃 取、离子交换柱层析、凝胶过滤、吸附树脂吸 附等方法比较常用。

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文献引用 1<<海洋微生物次级代谢产物中醌类化合物的 研究进展>> 2<<海洋微生物次生代谢产物的结构特征和生 物活性的研究进展>> 3<<海绵来源真菌Aspergillus sp BH4次级代谢产 物的初步研究>> 4<<海洋微生物低温碱性脂肪酶的纯化与性质 研究>> 5<<海滨土壤芽胞杆菌次级代谢产物发酵优化、 分离纯化及其性质的研究>>

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