实验和数据分析方法

时间：2025-07-09

基因芯片技术及其应用

Agilent 实验原理及步骤

基因芯片技术及其应用

一、总RNA抽提（TRIzol法）

1. 每2×107细胞加入1 ml Trizol，在旋涡震荡器上混匀；对于组织样品，每100mg组织可以加入1 ml Trizol，用液氮研磨或采用电动匀浆器充分打碎组织块。

2. 加入约1/5体积的氯仿，上下颠倒充分混匀1 分钟左右，室温下静置5 分钟。

3. 4℃，12,000 rpm 离心15 分钟后小心取出上清液，将上清夜转入新的1.5 ml离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温静置5 分钟。（15ml离心管用7,500rpm离心20min）

4. 4℃，12000 rpm离心10 分钟后，去上清，向沉淀中加入2/5体积的70% 乙醇， 4℃，12000 rpm离心洗涤沉淀15 分钟。（15ml离心管用7,500rpm离心20min）

5. 去上清，沉淀室温晾干后加入适量无RNA酶的水充分溶解沉淀，测定OD260 和OD280值。 (optional)对于从组织样本抽提的总 RNA，为了更好的去除基因组DNA 的污染，可以采用无RNA 酶的DNA酶I 处理，从而提高样品纯度。

二、总RNA质量检测（Lab on chip检测）

（一）琼脂糖胶电泳

1、配置用DEPC处理的电泳缓冲液50 TAE，高压灭菌后待用。

2、使用电泳槽前用3 H2O2浸泡15min，然后用DEPC处理的水冲洗，倒入适量1 TAE电泳缓冲液。

3、称取适量琼脂糖，加入1 TAE电泳缓冲液，制备1 的胶（注意使用专用的溶液和相关设备，避免引入外源RNA酶）。

4、用专用6 Loading buffer做指示剂，取10µl上样电泳（电压100伏）15min。

5、关闭电源，取出电泳胶，在凝胶成像仪上观测、拍照，保存图像。

6、评价总 RNA或 mRNA质量（见FAQ）。

通过目测28S和18S的亮度比例可以初步评价总RNA的质量。一般认为28S:18S 2可以初步判定总RNA质量较好，如图1所示。

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28S

18S

图1 1 agrose胶电泳人胎盘总RNA

（二）Lab-on-chip

1、胶制备取出400µl RNA gel Matrix，加入Spinfiter柱子，离心过滤凝胶（1500 g， 10min）。

2、取出130µl过滤胶到1.5mlEppendorf管中，再加入2µlRNA Dye Concentrate，在vortexer上振荡混匀。

3、用RNA ZAP清洁操作区，同时在Electrode cleaner中加入350µlZAP，放入Lab on chip正确位置，合盖清洁探头1min。

4、再用另外一Electrode cleaner中加入350µlDEPC 处理的H2O,重复步骤3。

5、移开Electrode cleaner,让探头自然干燥。

6、取出一新的RNA Chip，吸取9µl步骤2孔中。

7、将chip放置于带有活塞（plunger）的水平台上（chip priming station），将plunger拉杆向上拉倒1ml刻度出，再将chip priming station的盖子合上，压紧chip。同时向下推动拉杆至底部并维持30秒左右，松开让拉杆自动弹开。

8、从chip priming station上取出chip，用放大镜检查是否有气泡存在，如果在微通道中有气泡，需要重复步骤7。再在标有G的两个孔中各加入9µl步骤2制备的凝胶，在标有的孔中加入5µLrna 6000 Nano Marker。同时在12个加sample的孔中滴加5µl RNA 6000 Nano Marker（不能空一个孔）。

9、取1µl RNA 6000 ladder 滴加到标有的孔中，再各取1µl样品（RNA）

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加入12个样品孔中，并将chip放入IKA Vortexer上，在set-point振幅处振动1min（注意：必须卡紧chip，否则在振动过程中会跳出来）。

10、振荡好后的chip在5min之内必须放入Agilent 2100分析仪上，按照软件提示进行RNA电泳操作。

11、评价RNA质量。见（FAQ）

如图3

人报告》。Lab-on-chip 参照Agilent 2100分析仪操作手册，制备凝胶，按照软件提示进行RNA电泳操作，评价RNA质量。三、总RNA的纯化（QIAGEN RNeasy Mini Kit）

如果总RNA的纯度不高，会影响探针的标记效率和芯片杂交结果。所以使用QIAGEN RNeasy Kit纯化总RNA，详细操作原理和方法见RNeasy Mini Protocol。

1、取总RNA 100 µg溶解于100 µl RNase free水中，加入350 µlBuffer RLT并充分混匀。

2、加入250 µl无水乙醇，Tip头充分混匀。

3、将共计700 µl含总RNA的溶液转入套在2 ml离心管内的RNeasy 柱子内， 8000 g离心15-30sec，弃去滤过液。

4、吸取500 µlBuffer RPE到RNeasy mini 柱子内， 8000 g离心洗涤15—30sec，弃去滤过液，再用500 µlBuffer RPE在 8000 g离心洗涤2 min，弃去滤过液和2 ml的套管，将RNeasy mini柱子转入一新的1.5 mlEppendorf管中。

5、吸取 40 µlRNase free的水， 8000 g离心洗脱1 min。

6、重复步骤5一次。

四、cDNA第一链和第二链一步法合成

1、取400ng RNA于1.5ml离心管中，如下配置反应溶液：

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总RNA 400ng

T7 Promotor primer 1.2ul

Rnase-free Water X ul

总体积 11.5ul

2、 65℃保温10分钟，冰浴5分钟

注意：5×First Strand Buffer 在使用之前于65℃保温3-4分钟，并震荡混匀后离心。

3、配置如下cDNA合成体系：