两株柑橘采后致病真菌的分离及生物学特性

王 华，陶能国*，王长锋

（湘潭大学化工学院，湖南，湘潭 411105）

摘 要：从自然发病的宫川果实上分离得到两株致病真菌（PL,PQ），致病力检测结果显示，接种PL的柑橘果实发病到全部腐烂需7d，而接种PQ的柑橘果实则需13d,结合形态学特征确定两株致病真菌（PL,PQ）为指状青霉(Penicillium digitatum)和意大利青霉(Penicillium italicum)。基础生物学特性结果表明，指状青霉菌致死温度为70℃，菌丝体生长最适温度为25℃，最适pH=7；意大利青霉的致死温度为80℃，菌丝体生长的最适温度为20℃，最适pH=10。

关键词：柑橘；指状青霉；意大利青霉；生物学特性

中图分类号：S435 文献标识码：A 文章编号：

Isolation of two citrus postharvest pathogens and their biological characteristics

WANG Hua, TAO Neng-guo *, WANG Chang-feng

(College of Chemical Engineering, Xiangtan University, Xiangtan, Hunan 41105, China)

Abstract: We isolated the fungals from symptomatic oranges of Gongchuan in Hunan province. The pathogenicity of two Penicillium showed that the pathogenicity of PL is more strong than PQ ,only needed 7d and 13d , respectively .We identified them by morpHological characters analysis. The result showed that 2 typical pathogenic strains of Penicillium (PL, PQ) were identified as P. italicum and P. digitatum. .The research about biological charactersistics showed that : the lethal temperature and optimum temperature of P. digitatum was about 70℃ and 25℃, and the optimum pH=7. The lethal temperature and optimum temperature of P. italicum was about 80℃ and 20℃ ; and the optimum pH=10.

Key Word：Citrus; Penicillium species; biological charactersistics

柑橘属于芸香科（Rutaceae）柑橘属（Citrus）植物，是一种植面积比较广的农作物，遍及100多个国家（Smilanick）。我国是世界上种植面积最大的国家之一。由于柑橘的产地和消费区存在一定的距离，在贮存以及运输过程中很容易腐烂，所以每年因烂果损失在10%之间，严重的时候高达30%以上（陆宁海）。其中以真菌引起的侵染性病害是导致采后柑橘果实腐烂的主要原因，常见的有青霉病、绿霉病、黑腐病、蒂腐病、炭疽病、酸腐病等（孙萍）。由青霉菌引起青霉病和绿霉病最为严重（WURYATMO）。环境适宜的情况下，青霉菌可在田间侵染果实发病，或采后由健康果实携带进入销售市场或贮藏库，导致采后病害的大量发生，严重影响果实品质和商品价值（陆宁海）。

本研究从自然发病的宫川果实上分离得到两株青霉菌，采用形态学结合致病力检测的方法对筛选的菌种进行鉴定，并做一些基础生物学研究。为今后研究柑橘采后致病菌的防治提供理论基础。 收稿日期：

基金项目：国家自然科学基金（30901010）

通信作者：陶能国（1979-），男，湖南浏阳人，副教授，博士，主要从事柑橘贮藏与保鲜研究。E-mail：nengguotao@http://www.77cn.com.cn

1 材料方法

1.1 致病真菌的分离与形态学鉴定

将自然发病果实表皮用清水洗净，取约 3 mm×5 mm 的病组织数块，用 7 5% 乙醇消毒1 0 S ，再用0.1%的 HgCl2消毒4～6 mi n取出，用无菌水冲洗3次后，将病组织移于马铃薯葡萄糖琼脂( P D

A) 平板在2 8℃下培养，分离纯化得到供试菌株，备用。

将已经纯化好的病原菌在PDA培养基上划线培养三天，观察病原菌菌落形态，采用周德庆[2]的载片培养方法，将病原菌点接到滴有PDA培养基的载玻片上，放于培养皿中，每个培养皿中垫有一片湿润的滤纸片（灭菌）保湿，25℃培养箱中培养五天，显微镜下观察形态特征，参照真菌形态学鉴定手册[3]鉴定分离所得病原菌的种类。

1.2 致病力的检测

选取无机械损伤，无病虫害以及大小均一成熟度相同的宫川果实，用2%的NaClO溶液浸泡2min，后用清水清洗3次，室温环境下自然干燥。无菌操作台内用灭菌刀在果实的腰部刺4mm2的伤口，同时接种10 μL的菌悬液（1×107CFU/mL），接种果置于大的保鲜盒里，保持相对湿度95%左右，各处理10个果实，重复3次，每天记录发病情况。

1.3 致病真菌生物学特性观察

1.3.1 致病真菌最适温度的测定

将四株青霉菌接种到PDA培养基上，培养三天后，取直径为6mm的菌苔，将菌苔放置新的平板中，分别于15℃，20℃，25℃，28℃，30℃，35℃，37℃培养箱中，培养3天，用直尺记录菌丝体的直径。

1.3.2 致病真菌致死温度的测定

将PDA斜面上培养3天的病原菌制成浓度为1×104 CFU/mL的孢子悬浮液，然后取1 mL悬浮液分装于有9 mL无菌水的不同试管中，将试管分别放置-20℃，0℃，20℃，40℃，60℃，80℃，100℃下处理10min（待温度上升到预定值时开始计时）。之后用吸管取50μL孢子悬浮液到PDA培养基上涂平板，25℃下倒置培养，观察病原菌的菌落生长情况。

根据结果在60℃-80℃以5℃为梯度，进行进一步研究。

1.3.3 致病真菌最适pH的测定

将PDA培养基的pH从pH=2开始，以1个单位为梯度递增，直到pH=12。取培养3天后的直径为6mm菌苔，置于不同pH的培养基中，25℃下倒置培养3d。观察菌落直径生长情况。

1.4 数据分析

采用常规的分析方法来标注标准偏差，数据分析采用SPSS16.0统计分析软件，ANOVA来分析显著性差异（p<0.05）

2 结果分析

2.1 致病真菌的分离及致病力的检测

从自然发病的柑橘果实上共分离得到两株病原菌，具有较强的致病力。PL致病菌在果实表面发

病症状为：开始为水浸状，然后出现白色霉层，边缘不规则，然后中间出现绿色霉层扩展迅速，发病到全果腐烂只需7天，全果腐烂后有香味. PQ致病菌在果实上的发病症状为：开始在表皮出现水浸渍，开始为白色霉层，边缘不整齐为白色，表面干燥，然后中间逐渐出现蓝色霉层扩展速度较慢，发病到全果腐烂需要13天，全果腐烂有浓重霉味。一般从第2天开始有发病迹象，7d和13d三组果实全部腐烂。见表1和表2。

表1 PL不同培养时间致病力情况

时间（d）

直径（mm）

发病率（%） 1d 4.0 0 2d 10.0 6.6 3d 33.3 53.3 4d 50.0 93.3 5d 80.0 100 6d 96.0 100 7d 98.0 100

表2 PQ不同培养时间的致病力情况

时间（d） 1d 2 d 3d 4d 5d 6d 7d 8d 9d 10d 11d 12d 13d

直径（mm） 4.0

发病率（%） 0 11.6 15.6 32.6 40.3 49.8 52.1 54.3 61.2 66.4 79.7 83.0 98.0 6.6 70 73. 92.3 96.6 96.6 100 100 100 100 100 100

2.2 致病真菌形态学鉴定

病原菌A在PAD上菌落开始为白色绒毛状，生长速度较快，逐渐中间变为绿色霉层，较宽约为9-15mm，边缘为白色绒毛不整齐，整个菌落表面干燥，成粉粒状，有特殊香气。镜检观察其分生孢子梗无色，较短，帚状枝较大，小梗稍宽，顶端尖细，分生孢子串生，单孢无色，卵圆或椭圆形，较大，大小为3.93-5.2×5.24-6.55 µm。

病原菌B在PDA上开始为白色绒毛较稀疏，菌落较宽在3mm-15mm之间，后菌落转为蓝色，基质变暗略显灰绿色，菌落上有少量白色气生菌丝突起，边缘不整齐，菌落干燥疏松，成粉粒状，有霉味。镜检观察分生孢子梗无色，扫帚状，有两个分支，小梗顶端尖细，分生孢子串生，单孢无色成不规则的椭圆形，大小为3.4-5.24×3.93-6.5 µm。

由致病力结合形态学可以确定两株致病真菌（PL,PQ）分别为：指状青霉（Penicillium digitatum）和意大利青霉（Penicillium italicum）。

2.4.致病菌的生物特性观察

2.4.1致病菌最适温度

从下表，结果表明：高温和低温都不利于青霉菌的生长，温度在35℃时，三天后菌丝体均没有生长，所以高温对菌丝体生长更为不利。指状青霉菌丝体生长最适温度为25℃。意大利青霉菌丝体生长的最适生长温度为20℃。

2.4.2青霉菌致死温度

培养三天后，发现-20℃，0℃，20℃，40℃条件下处理后菌落数没有明显差异，60℃处理后菌落数明显减少。两株青霉菌在80℃处理10min后，没有长出菌落。通过进一步研究结果表明：指状青霉在65℃时长出了3个菌落，意大利青霉经75℃处理后长出了1个菌落。所以指状青霉的致死温度为70℃左右。而意大利青霉较耐高温，80℃左右为致死温度。

2.4.3 青霉菌最适PH

PH值的变化对菌丝体生长不是特别的敏感，PH在2~12之间菌丝体均可以生长。从上表结果表明：指状青霉菌菌丝体生长的最适pH=7，意大利青霉的最适生长pH=10，两种青霉菌表现出了明显差异性。

3 讨论

柑橘园里的生态系统通常相对比较稳定，指状青霉和意大利青霉是国内外大多数学者公认的柑橘采后致病菌，本试验采用传统病原形态学的鉴定方法，结合致病力分析与已报道的柑桔青霉致病菌的特征进行比对，从而得出病害主要由指状青霉和意大利青霉所致。

由于大多数青霉都有固定的寄主，指状青霉和意大利青霉的寄主是柑橘，对其他的水果没有致病力的作用[6]。为了更好地防治果蔬采后病害，了解和掌握各种病害病原菌的生物学特性，逐步受到人们的重视。本实验从自然发病的柑橘中分离得到了指状青霉、意大利青霉，研究了两株致病真菌的生物学特性，结果表明：指状青霉菌致死温度为70℃，意大利青霉的致死温度为80℃，意大利青霉比指状青霉更具有耐高温的特性与闵晓芳[7]报道一致。指状青霉菌丝体生长最适温度为25℃,意大利青霉菌丝体生长的最适温度为20℃，柑橘青霉菌的生长明显不如绿霉菌。与前人报道的基本一致（陆，曹，闵，龚国书）。柑橘青霉菌的生长明显不如绿霉菌，分形维数也比绿霉菌小

指状青霉和意大利青霉是国内外大多数学者公认的柑橘采后致病菌，也有一些学者研究表明除了这两种青霉以外，扩展青霉和波兰青霉也存在致病力[8] ，这可能与时间、品种、以及地域环境有极大的关系，因此还需要更广泛和全面的研究。

4 结果

过传统形态学结合致病力结合的方法确定两株菌株为指状青霉(Penicillium.digitatum)，意大利青霉(Penicillium italicµm)，两株青霉的致病力检测结果为：指状青霉致病力更强一些，从果实发病到

全部腐烂只需要7d，意大利青霉需要13d。生物学特性研究表明：指状青霉菌致死温度为70℃，菌丝体生长的最适温度为25℃，最适PH=7；意大利青霉的致死温度为80℃，菌丝体生长的最适温度为20℃，最适PH=10。

参考文献

Smilanick, J.L., Mansour, M.F., Margosan, D.A., Mlikota Gabler, F., Goodwine, W.R.,2005. In uence of pH and NaHCO3 on effectiveness of imazalil to inhibit germination of Penicillium digitatum and to control postharvest green mold on citrus fruit. Plant Dis. 89, 640–648.

田世平, 范青. 控制果蔬采后病害的生物学技术. 植物学报[ J], 2000, 17 (3): 211-217.

陆宁海, 徐瑞富, 吴利民等. 柑橘青霉菌侵染条件及致病性研究[ J]. 福建果树, 2005, 132(1): 6-8.

[2]周德庆.微生物实验手册[M].上海：上海科学技术出版社，1986：258-267.

[3]魏景超.真菌鉴定手册[M].上海: 上海科学技术出版社，1979.501-502.

[6] Stange ect Differential effects of citrus peel extracts on growth of Penicillium digitatum.p.italicum and p.expansµm. [J] PHysiological and modecular plant pathology,2002.303-311

[7]闵晓芳 陈丽锋 邓伯勋.柑桔青绿霉病病原菌的分离及其生物学特性研[J].中国南方果树. 2007.36:3.

[8] 闵晓芳，邓伯勋，陈丽锋，余 慧.柑橘采后致病青霉的鉴定[J].果树学报，2007.653-656. 闵晓芳，柑橘采后致病青霉的分离鉴定及其生物学特性研究，硕士论文，2007

张红印，蒋益虹，郑晓东，席玛芳，孙萍．酵母菌对果蔬采后病害防治的研究进展．农业工程学报，2003，19(4)：23-26．

ERMINAWATI WURYATMO,ANDREAS KLIEBER,* AND EILEEN S. SCOTT Inhibition of Citrus Postharvest Pathogens by Vapor of Citral and Related Compounds in Culture。J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 2637 2640 。

孙萍．粘红酵母对柑橘采后病害的生物防治及其防治机理的研究．浙江大学(硕士论文)，2003．

曹若彬．果树病理学(第三版)．北京：中国农业出版社，2001． 1

张唯一，毕阳．果蔬采后病害与控制．北京：中国农业出版社．1995

龚国淑 邓小刚，柑橘青霉菌和绿霉菌菌落的分形特征（面向21世纪植物保护）