病毒空斑纯化步骤

猪流行性腹泻病毒(PEDV)纯化分离方案

(1) 将已准备好的VERO细胞消化均匀铺于6孔板中。

(2) 细胞长成单层后吸去培养液，将病毒做10倍稀释，共做5个梯度并向每孔滴加0.4ml稀释好的病毒液, 置37℃吸附2小时后弃残液。

(3) 制备2％的琼脂糖（PCR电泳胶一样的琼脂糖），置40－50℃水浴待用。

(4) 将上述琼脂糖和双倍维持液（1:1）混合后，加入培养板各孔，每孔2ml，使冷却凝固成覆盖层。

(5) 把培养板倒置，在37℃二氧化碳培养箱培养48h。

(6) 制备含0.002％中性红的2%琼脂糖：双倍维持液（1:1），置40－50℃水浴待用。

(7) 吸取上述琼脂加入培养板各孔，每孔2ml，使冷却凝固成第二覆盖层。

(8) 把培养板倒置，在37℃二氧化碳培养箱继续培养，48小时内观察结果。

(9) 挑出蚀斑下的细胞作病毒的进一步增殖和鉴定。

主要问题：

1、 铺完琼脂糖层之后，24h之后细胞轮廓模糊，不清晰。48h之后有些孔的细胞基本上看不清了，但是这都不是病毒造成的。（支原体的存在会不会导致这种情况）

2、 使用中性红染色在一开始就染色还是等病毒造成一定的噬斑再染色，覆盖一层还是两层琼脂糖层？

3、 使用的琼脂糖是不是有问题，与琼脂区别大不大？

4、 之前按照这个方法加了中性红的琼脂糖层之后，细胞着色很不理想。看不出明显的染色区域，只是有些红色的点点。

5、 温度不会出现问题，因为把握的很好，细胞不会被烫死的。就是不知道自己配制的液会不会由于渗透压的原因导致细胞死亡。

6、 一直拿不出照片的原因就是没法看到空斑，板孔中不能显示出一个一个比较像样的噬斑，我挑也是挑病变情况有点不一样的病灶。