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生物技术通报

综述与专论

ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＢＵＬＬＥＴＩＮ

２００６年第３期

双向凝胶电泳的实验操作及进展

叶妙水

钟克亚

胡新文

郭建春

５７１１０１）

（中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海口

摘要：双向聚丙烯酰胺凝胶电泳是研究蛋白质组的核心技术，本文重点介绍了双向凝胶电泳的原理、实验操作过双向凝胶电泳

蛋白质组

等电聚焦

程中的具体步骤以及近年来在实验过程中发展的一些新方法和进展。

关键词：

ＰｒｏｃｅｓｓｏｆＴｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌＥｌｅｃｔｒｏｐｈｒｅｓｉｓａｎｄＩｔｓＰｒｏｇｒｅｓｓ

ＹｅＭｉａｏｓｈｕｉＺｈｏｎｇＫｅｙａ

ＨｕＸｉｎｗｅｎＧｕｏＪｉａｎｃｈｕｎ

（ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＴｒｏｐｉｃａｌＣｒｏｐｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＴｒｏｐｉｃａｌＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｉｋｏｕ５７１１０１，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：

Ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（２Ｄ－ＰＡＧＥ）ｉｓａｋｅｙｔｅｃｈｎｉｑｕｅｆｏｒｐｒｏｔｅｏｍｅｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｔｈｉｓ

ａｒｔｉｃｌｅｈａｖｅｓｕｍｍａｒｉｚｅｄｔｈｅｔｅｃｈｎｉｃｐｒｉｎｃｉｐｌｅ，ｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｍａｎｉｐｕｌａｔｅａｎｄｔｈｅｎｅｗｍｅｔｈｏｄｓａｎｄｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｗｈｉｃｈｈａｄｄｅｖｅｌｏｐｅｄｒｅｃｅｎｔｌｙｏｆＴｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓＰｒｏｔｅｏｍｅ

Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃｆｏｃｕｓｉｎｇ

聚丙烯酰胺凝胶双向电泳（Ｔｗｏ－Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ剂（Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ）、和还原剂的复杂混合液。同时还可以通过样品制备方法来从蛋白质混合物中富集各种亚组分。用于样品处理的缓冲液必须在低离子强度的基础上，既能保持蛋白质的天然电荷，又能维持其溶解性。因此，绝大多数样品往往都需要通过多次实验才能摸索到最适宜的条件。

Ｆａｒｒｅｌ于１９７５年建立Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２－ＤＥ）是由Ｏ’

的［１］。经过３０年的发展，目前双向电泳技术已被广泛应用于生物、医学和农业等领域的研究。目前一般可以在一块凝胶上分辨出１８００多个蛋白质点（ｓｐｏｔ），能同时分析成百上千的基因表达产物，非常适于平行分析大量的蛋白质系。因此成为目前蛋白质组研究中最重要的分离手段及支撑技术之一。双向电泳一般包括样品制备、等电聚焦（Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ

１．１样品的溶解

蛋白样品的有效溶解是双向电泳成功分离蛋

白质的最关键因素之一。样品溶解要达到的目标是：１）样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚集体完全破坏，成为各个多肽的溶解液；２）溶解方法必须去除可能干扰２－ＤＥ分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质；３）溶解方法要保证样品在电泳过程中继续保持溶解状态。

尽管利用离液剂、去垢剂、两性电解质、缓冲液、还原剂等化合物，可以使样品中的蛋白质溶解，但并非所有化合物在化学和电荷等方面都能满足用于等电聚焦ＩＰＧ胶条和等电聚焦技术（ＩＥＦ）要求。

的化合物不能增加溶液中的离子强度，如果用一些

Ｆｏｃｕｓｉｎｇ，ＩＥＦ）、ＳＤＳ－聚丙稀酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－

染色和图像扫描及图像处理分析、蛋白鉴ＰＡＧＥ）、定等步骤。

１样品制备

双向电泳成功的关键在于建立一套有效的、可

重复的样品制备方法［２］。样品制备的影响因素包括蛋白质的溶解性、分子量、电荷数及等电点等。对于不同的样品性质及研究目的，其方法也不尽相同。不同的样品性质，可选择具有单一增溶作用的溶液，也可用含多种离液剂（ＣｈａｏｔｒｏｐｉｃＡｇｅｎｔｓ）、去垢

收稿日期：２００５－１２－２８

基金项目：海南省教育厅科研基金重点项目（ＨＺＫＺ２００４０３）、海南省自然科学基金（３０４０６）和中国热带农业科学院（Ｒｋｙ０５２６）作者简介：叶妙水（１９８２－），男，汉族，在读硕士研究生，研究方向：植物基因工程

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６生物技术通报ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＢｕｌｌｅｔｉｎ

２００６年第３期

强离子强度的化合物（例如高浓度的ＮａＣｌ溶液），会导致升压过程中电流太大而影响聚焦结果。

下，再加用还原剂可使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。还原剂帮助打开蛋白质的二硫键，使待分析的蛋白质分离成为单一的蛋白亚基，对双向电泳非常重要。

通常使用的还原剂为自由硫醇试剂如β－巯基乙醇或二糖硫苏醇（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ，ＤＴＴ）以及不带电荷的三丁基膦（Ｔｒｉｂｕｔｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅ，ＴＢＰ），前者是一种硫醇还原剂，当其浓度达到５０ｍＭ时可促进大多数蛋白的半胱氨酸残基被还原，但由于ＤＴＴ的ｐＫａ约为

１．１．１离液剂离液剂也叫变性剂（ＣｈａｏｔｒｏｐｉｃＡｇｅｎｔｓ），

其典型代表是尿素和硫脲。尿素是双向电泳样品制备时最常用的变性剂，硫脲则可以帮助许多难溶的蛋白质进行溶解。尿素和硫脲能够破坏蛋白质分子间形成的氢键，从而防止由氢键引起的蛋白质聚集及蛋白迁移中二级结构的形成。尿素的常用浓度为

８Ｍ，过低则达不到完全溶解样品的目的。单用硫脲

在水中的溶解度很低，高浓度尿素溶液能增强其溶解度，通常选用含５￣８Ｍ尿素和２Ｍ硫脲的混合缓冲液［３］。

８．０，因此ＤＴＴ的浓度太高会影响样品的ｐＨ梯度。ＴＢＰ是比ＤＴＴ更有效的一种还原剂，它不带电荷，

而且在几个ｍＭ浓度下就可以还原胱氨酸［７］。但它比ＤＴＴ更难进行化学处理，目前有一些公司可以提供较高浓度（２００ｍＭ）的溶液。

１．１．２表面活性剂表面活性剂也称去垢剂

（Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ）。经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还需要至少一种表面活性剂来溶解疏水基团，消除疏水基团之间的相互作用，增强蛋白质在其等电点（ｐＩ）值处的溶解性。强离子型去垢剂如

１．２样品的预分级

降低蛋白样品的复杂度，可以在双向电泳中增

强低丰度蛋白的可见度。降低样品复杂度的方法包括：顺序抽提法［８］、亚细胞分离、层析法、或是用制备型等电聚焦设备进行样品制备。

ＳＤＳ会影响蛋白所带的电荷，一般不适合在等电聚

焦中使用，因此使用时尽量选用非离子型或两性离子表面活性剂，从而保证蛋白质仅依靠其自身的电荷进行移动。常用的非离子型去垢剂是辛葡糖苷（ｏｃｔｙｌｇｌｕｃｏｓｉｄｅ），两性去垢剂如ＣＨＡＰＳ及其羟基衍生物ＣＨＡＰＳＯ等，一般使用浓度都是１％￣２％［４］。现在新出现的一些去垢剂如ＳＢ３－１０和ＡＳＢ－１４［５］也能用于蛋白质组研究中的样品制备。某些特殊样品只有在去垢剂浓度达到４％时才会溶解［６］。

１．２．１顺序抽提法顺序抽提即利用蛋白样品在

不同的缓冲液中相对溶解度不同而将其溶解在不同的溶液中进行２－ＤＥ的方法。顺序抽提可提高样品蛋白的提取［９］。

用Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ／ＥＤＴＡ→Ｔｒｉｔｏｎｘ－１００／ＥＤＴＡ→Ｔｗｅｅｎ４０／

Ｄｅｏｘｙｏｈｏｌａｔｅ顺序抽提可以从一个细胞样品中依次

分离出细胞液、膜结构／细胞器、核和细胞骨架［１０］。利用三种溶解性逐渐增强的溶液：试剂１用于抽提可溶性蛋白质（如胞内蛋白），试剂２抽提中等溶解度的蛋白质，试剂３则用于抽提前两种试剂都不溶解的蛋白质。将生物样品进行分步抽提可得到三组溶解性不同的样品产物，再分别将它们进行双向电泳，可以检测出比单用任何一种方法处理的同源样品更多的蛋白质点，且特定蛋白质的浓度得到增强［８，１１］。

１．１．３两性电解质由于有些蛋白质需要在盐离

子的作用下才能保持溶解状态，否则这些蛋白质在处于其等电点时会发生沉淀。盐离子的存在有助于样品的溶解，但却使聚焦过程中电流增大而造成升压过程缓慢、聚焦时间延长；低盐或无盐虽然有利于升压和缩短聚焦时间，但会使那些依靠盐离子溶解的蛋白质发生沉淀。解决该问题的方法是在溶液中加入两性电解质来代替盐离子，因此所有等电聚焦溶胀缓冲液和样品溶液中都要加入两性电解质来帮助蛋白质溶解。通常两性电解质在ＩＰＧ胶条上样缓冲液中的浓度不超过０．２％（ｗ／ｖ），因为高浓度的载体两性电解质所带电荷较多，可限制因电压的升高而延长等电聚焦的时间。

１．２．２亚细胞分离亚细胞分离即将样品蛋白质

分离成不同的细胞器进行２－ＤＥ的方法。常用的方法包括密度梯度、免疫分离细胞和组织、蛋白质的亲和富集等［１２￣１４］，可以得到细胞核组分、线粒体、高尔基体、溶酶体和吞噬体等。由于研究对象变为细胞蛋白组的亚群，蛋白质的多样性和复杂性得到降

１．１．４还原剂在变性剂和表面活性剂联用条件

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２００６年第３期

叶妙水等：双向凝胶电泳的实验操作及进展７

低，可使低表达蛋白富集并得到分析，同时对进一步了解蛋白质定位和信号转导具有重要的意义。

焦实验的最主流技术。在进行等电聚焦中，保持ｐＨ梯度的稳定性、线性和可重复性，对实验至关重要，而ＩＰＧ胶条可最大程度的满足这种要求［１６］。

１．２．３蛋白样品的纯化双向电泳实验对蛋白质

样品的要求非常严格，样品中的任何杂质都会对其后的等电聚焦过程产生影响。因此，必须通过纯化尽可能的将样品中的各种去垢剂、盐份、多肽、核酸、脂类、酚和其它一些小离子（可降低蛋白样品的导电性），同时对低浓度样品进行浓缩；另外，须将半胱氨酸形成的二硫键还原，并使之长时间处于还原状态（一般采取烷基化），保持样品的溶解性。

２．１．１ｐＨ梯度范围的选择依据研究的目的，应

选择适当ｐＨ梯度范围的胶条。由于生物体中大部分蛋白的等电点在ｐＨ４￣８之间，线性宽ｐＨ范围的胶条（ｐＨ３￣１０）尽管可以在同一块凝胶上显示样品中绝大多数的蛋白质，但大量的蛋白点都集中在胶条的中间，两端的蛋白点较少，从而造成中间的分辨率较低。

使用窄范围重叠ｐＨ梯度的胶条（ｐＨ３￣６，ｐＨ５￣

１．３预防角蛋白的污染

当使用灵敏度较高的检测方法时，样品的处理

８，ｐＨ７￣１０）可以大大提高分辨率和灵敏度。如果用

同样长度的３根窄ｐＨ梯度的胶条代替一根宽ｐＨ范围的胶条（ｐＨ３￣１０）进行电泳，窄范围ｐＨ胶条自身的ｐＨ范围很窄，而胶条的长度未变，蛋白点的分辨率比宽ｐＨ范围胶条要高；又因为对每根胶条来说超出其ｐＨ范围之外的蛋白质不被聚焦，所以每根胶条允许有更多的上样量。由于这三种窄范围

应非常小心，尽量避免角蛋白的污染。银染时常会在５０￣７０ｋＤ的区域看到人工假点，以及明显的与移动方向平行的不规则垂直条纹，这是由污染的皮肤角蛋白降解所引起的（样品溶液中的角蛋白通常聚焦在ｐＨ５附近）。皮肤角蛋白也是质谱中最常见的污染物。防止角蛋白污染的方法包括将单体溶液、样品储液、凝胶缓冲液、以及电泳缓冲液等用硝化纤维膜过滤后储存与干净容器中，用清洁剂彻底清洗电泳装置，所有的实验操作都戴手套进行等。

ｐＨ梯度的胶条有一个ｐＨ的重叠，因此利用双向电

泳图象分析软件可以将重复区域的蛋白质斑点进行匹配，从而得到一张合成图“ｃｙｂｅｒｇｅｌ”，该合成图中能观察到的蛋白点要明显多于单用一根宽范围的胶条所分离得到的蛋白点。微范围ｐＨ梯度胶条（ｐＨ３．９￣５．１，ｐＨ４．７￣５．９，ｐＨ５．５￣６．７，ｐＨ６．３￣８．３）能进一步提高凝胶的分辨率，尤其适用于低丰度蛋白的检测。

２第一向分离：等电聚焦

蛋白质是两性分子，在不同的ｐＨ环境中可以

带正电荷、负电荷或不带电荷。对每个蛋白质来说都有一个特定的ｐＨ，此时蛋白质的静电荷为零，此

ｐＨ值即该蛋白质的等电点（ｐＩ）。将蛋白质样品加

载至ｐＨ梯度介质上进行电泳时，它会向与其所带电荷相反的电极方向移动。在移动过程中，蛋白分子可能获得或失去质子，并且随着移动的进行，该蛋白所带的电荷数和迁移速度下降。当蛋白质迁移至其等电点ｐＨ位置时，其净电荷数为零，在电场中不再移动。聚焦是一个与ｐＨ相关的平衡过程：蛋白质以不同的速率靠近并最终停留在它们各自的ｐＩ值；在等电聚焦过程中，蛋白质可以从各个方向移动到它的恒定位点。

２．１．２凝胶尺寸的选择商品化的ＩＰＧ胶条的长

度有７、１１、１７、１８、２４ｃｍ等几种规格，不同长度的胶条聚焦时的条件不同，用途也有一定的差异。小尺寸胶条的电泳时间短，可用于优化样品制备等预实验；而大尺寸胶条的电泳时间长，则用于对复杂样品进行更为彻底的分析并鉴别出感兴趣蛋白。

有时也可以用小尺寸、重叠窄ｐＨ范围的ＩＰＧ胶条来聚焦感兴趣蛋白。如前所述，利用３种窄ｐＨ范围的、有重叠区域的预制ＩＰＧ胶条走出来的蛋白质图谱，经过软件对重叠区进行处理，能使ｐＩ的有效宽度增加两倍多，可完全取代大尺寸胶条。

２．１固相ｐＨ梯度胶条的选择

尽管固相ｐＨ梯度胶条（ＩＰＧ）、或载体两性电解

质管状凝胶，都可以用于蛋白质的等电聚焦分离［１５］，但前者比老的管状电泳方法分离有重复性好、操作方便、可高通量操作等众多优点。ＩＰＧ是当前等电聚

２．２蛋白质的上样２．２．１上样量的确定

将样品上样到ＩＰＧ胶条中

的量变化范围较大，可从几微克到１毫克以上。决

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８生物技术通报ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＢｕｌｌｅｔｉｎ

等电聚焦。

２００６年第３期

定具体上样量的因素有很多，其中最主要的是：

（１）分析的要求：目的蛋白的上样量一定要达到检测范围。如用７ｃｍ胶条和考马斯亮蓝染色，

等电聚焦时，胶条的导电性会随时间的改变而发生变化，尤其在开始的一段时间更为明显。当等电聚焦开始时，ＩＰＧ胶条在电场作用下会出现许多载体电荷，导致胶条中产生非常高的电流。随着聚焦过程的进行，带有电荷的杂质移动到电极处、蛋白质移动到与它们的ｐＩ值相同的ｐＨ点，每个蛋白和载体两性电解质电荷就会减少，电阻逐渐增加，电流会逐渐降低。

胶条的ｐＨ范围、长短、及所加载的电场都会对等电聚焦的结果产生影响。理论及实验数据表明，相邻两蛋白点的分辨率与ｐＨ梯度的平方根成正比，与电压梯度的平方根成反比［１５，１８］。因此选用相对窄范围的ｐＨ胶条、采用高电压就可以得到较好的聚焦结果。而要想得到最好的结果，就必须使用窄范围的ＩＰＧ胶条，同时加以高电压。

要得到稳定、重复性好的等电聚焦结果，就必须维持伏特小时数（ｖｏｌｔ－ｈｏｕｒｓ）的一致。用分步升压的方法来达到设定的最终聚焦电压，对等电聚焦结果非常重要。升压过程能够从ＩＰＧ胶条中清除样品中所有的离子成分，同时又能减少胶条因电流而产生的热量。样品聚焦所需要完成的伏特小时数主要由样品复杂性决定，样品越复杂，聚焦的伏特小时数相应增加。

因为ＩＰＧ凝胶的ｐＨ梯度是固定的，聚焦后的蛋白质在它们的ｐＩ值处比常规的ＩＥＦ凝胶稳定。聚焦后的ＩＰＧ胶条可在－２０℃长期保存，而不会影响最终的双向电泳图象。

１００ｕｇ的总蛋白上样量，可以检测到复杂样品中表

达中等的蛋白质；同样的上样量，用银染或荧光染料蛋白质凝胶等更灵敏的染色方法可以检测到许多低丰度的蛋白质。

（２）样品的复杂性：高度复杂的样品中含有多种浓度相差很大的蛋白质，这就需要一个相对折衷的上样量来保证高丰度的蛋白质不影响低丰度蛋白质的观察。通过预分级富集蛋白的方法，可以使样品中特定类型的蛋白质浓度增加，这样各种蛋白质的浓度都可以达到一个比较适合的数值，即使是低丰度的蛋白质也可以有足够的上样量。

（３）ＩＰＧ胶条的ｐＨ范围：通常窄ｐＨ范围的胶条蛋白质上样量大，因为只有ｐＩ值在第一向胶条

ｐＨ范围内的蛋白质才会在第二向凝胶中出现。２．２．２

溶胀上样

蛋白质的上样主要有溶胀加样

和杯上样两种方法。因杯上样法难以操作且人为因素影响大，所以通常不选择这种方法，现主要介绍溶胀加样法。

因为商品化的ＩＰＧ胶条都是脱水的干胶条，在使用时需要将它溶胀到０．５ｍｍ厚度。所以若在溶胀缓冲液中加入预制好的蛋白质样品，样品中的蛋白质在溶胀过程中将被均匀地吸收进入整个胶条中

［１７］

，此即溶胀上样。

胶条在含有样品的上样溶液中至少需溶胀１１

个小时以上才能进行聚焦，此时胶条被充分泡胀，其中孔径都扩张至最大，样品中的大分子蛋白有更充分的时间进入胶条。

溶胀加样的优点有：（１）样品上样非常简单。

（２）溶胀前上样解决了用样品杯上样时出现的样品沉淀问题。

（３）在等电聚焦前蛋白质样品已经完全进入胶条，所以可缩短聚焦时间。

（４）提高蛋白上样量。

３第二向分离：ＳＤＳ－聚丙稀酰胺凝胶电泳

双向电泳的第二向是将ＩＰＧ胶条中经过第一

向分离的蛋白转移到第二向ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶上，根据蛋白相对分子质量或分子量（ＭＷ）大小与第一相垂直的分离。

蛋白质与十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ）结合形成带负电荷的蛋白质－ＳＤＳ复合物，由于ＳＤＳ是一种强阴离子去垢剂，所带的负电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量，能消除不同分子之间原有的电荷差异，从而使得凝胶中电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于蛋白质分子的质量大小，其迁移率与分子量的对数呈线性关系［１５，１８］。在蛋白

２．３等电聚焦（ＩＥＦ）

胶条充分溶胀后，用湿润的滤纸小心的吸干胶

条上的多余液体后，将其转移到等电聚焦盘中进行

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２００６年第３期

叶妙水等：双向凝胶电泳的实验操作及进展９

质组研究中，需要在同样的条件下同时走多块胶，这对凝胶与凝胶之间的比较十分重要。

须去除。通常在刚加入琼脂糖后，赶快用压舌板轻压胶条塑胶支撑膜的上方，驱赶气泡。

３．１ＩＰＧ胶条的平衡

胶条由第一向转移到第二向之前，需要先进行

３．３电泳及分子量大小计算

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ中多肽的移动速度与分子量的对数

成反比。多肽分子量越大，它在凝胶中的移动速度越慢，蛋白质分子量的对数与它的移动距离成线性函数。在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ中，可以通过未知蛋白质点与已知标准蛋白质位置的比较来确定蛋白质的分子量。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ梯度胶也同样可以用来计算蛋白质分子量，此时ｌｏｇ

平衡。这一过程包括蛋白质二硫键的还原、半胱氨酸残基的烷基化，以及样品与ＳＤＳ结合为第二向根据分子量（ＭＷ）的分离做准备。平衡步骤：将胶条放入槽中，胶面朝上，首先在ＤＴＴ平衡液中轻微摇荡

１０分钟，然后弃掉平衡液，再重新注入碘乙酰胺平

衡液１０分钟。平衡过后，取出ＩＰＧ胶条，进行包埋。

平衡母液为：６ＭＵｒｅａ尿素；２％ＳＤＳ；０．０５Ｍ

ＭＷ与ｌｏｇ（％Ｔ）成正比，因为是线

性梯度胶，％Ｔ又与移动距离成正比，因此ｌｏｇＭＷ也与移动距离成正比。

分子量标准曲线是Ｓ形的，因此标准曲线中的线性部分不能涵盖凝胶中所有蛋白质的分子量范围。但是，因ｌｏｇＭＷ的变化相当慢，所以无论是否在线性范围内，都可以在一个相当宽的范围内相对精确的计算出分子量［１５，１８］。

Ｔｒｉｓ／Ｈｃｌ；２０％甘油。

ＤＴＴ缓冲液则在母液中加入ＤＴＴ使终浓度为２％。

碘乙酰胺平衡液则在母液中加入碘乙酰胺使终浓度为２．５％。

３．２胶条的转移及包埋

将第二向凝胶稍微向后倾斜放置（约３０度

４凝胶中蛋白的检测

凝胶染色的目的是使其中的蛋白质能够被观

角）。将带有塑胶支撑的ＩＰＧ胶条置于凝胶的上方的玻璃板上，塑料膜背贴玻璃板。用压舌板轻轻的向下推动胶条，注意不能损坏胶条。确保ＩＰＧ胶条正好位于第二向凝胶的上方，与凝胶完全接触，然后再覆盖上０．５％￣１．０％熔融的用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳缓冲液配制的琼脂糖（在琼脂糖中加入少量的溴酚兰，可以观察到电泳的进程）。琼脂糖的温度不能太高，热的琼脂糖会加速平衡缓冲液中尿素的分解。当用琼脂糖覆盖胶条时，常会在胶条的下面或背面形成气泡。这些气泡会干扰蛋白质的迁移，所以必

表１

染色方法银染

［２０］

察到。目前还没有通用的染色方法，只能在考虑多种因素如需要的灵敏度、线性范围、方便程度、费用、以及成像设备类型等基础上，结合实际进行选择。有时也可以将蛋白转膜后通过免疫印迹的方法来进行检测。

４．１染色法检测蛋白

双向电泳的目的包括分析和制备。实验目的不

同，样品上样量和检测方法也不同。最常用的方法是通过普通染料或金属染料来检测凝胶中的蛋白

几种主要染色方法比较

特点

最敏感的非放射性显影方式，低背景，质谱匹配方法简便，定量优于银染，质谱匹配显影敏感度高，定量性差，质谱匹配定量佳，质谱匹配

应用两种不同的染料荧光标记两个样品

灵敏度

２～５ｎｇ８～４０ｎｇ４～８ｎｇ１～１０ｎｇ１～１０ｎｇ

考马斯亮蓝金属锌负染色［２１］荧光标记染色［２２］差异凝胶电泳［２３］

质。因为各种染色方法灵敏度的不同和不同类型的蛋白质对不同的染色方法有特异性，所以各种染色方法都各有其优缺点。

如果要检测低丰度的蛋白质，就需要加大蛋白质的上样量（０．１￣１ｍｇ／ｍｌ），同时采用高灵敏度的染

色方法，比如银染或荧光染色［１９］。如果是要制备足够的样品作为抗原或用来测序，也需要加大蛋白质上样量，同时要选用的染色方法不会将蛋白质固定在凝胶中。若需进行蛋白质含量的比较，则需选用检测线性范围大的染料。染色所能达到的灵敏度由

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１０生物技术通报ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＢｕｌｌｅｔｉｎ

２００６年第３期

以下因素决定：１）与蛋白质结合的染料数量；２）染色的强度；３）凝胶上的蛋白质和凝胶背景之间的差异———即信噪比（表１）。

以用于药物设计，研究疾病的致病机理等。

参考文献

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４．２免疫印迹法检测蛋白

某些合成的膜可与蛋白质分子紧密结合，其强

度足以保证可以在膜上作固相的免疫测定、染色、或其它的固相分析。通常将电泳分离出的蛋白质组分转移到支撑膜上的方法，称为免疫印迹法。结合到膜上的蛋白质分子仍保留其天然抗原性且更容易与抗体反应。现已发展出很多种可直接探测合成膜上的蛋白质分子的技术。

６７８

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５图像采集和分析

成像设备可以摄入图像，对凝胶图像以数字形式

保存，对每块凝胶图像进行平等的比较，在各研究组之间传递信息，并对大量的数据进行归类分析。目前应用较为广泛的图像分析软件有ＰＤＱｕｅｓｔ、

９１０１１１２１３１４１５１６１７

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ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ２ＤＥｌｉｔｅ、Ｍｅｌａｎｉｅ、ＢｉｏＩｍａｇｅＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ

等，分辨率较高，功能齐全。尽管如此，仍不可避免约删除和分割１０％的未检出点和假点，需要手工添加、

［１１］

ＧｏｒｇＡ，ＢｏｇｕｔｈＧ，ＫｏｐｆＡ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２００２，２（１２）：１６５２～１６５７．ＧａｔｌｉｎＣＬ，ＥｎｇＪＫ，ＣｒｏｓｓＳＴ．ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０００，７２（４）：７５７～７６３．

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。图像采集完成后，可以应用各种分析软件进行分

析，可以收集、诠释、比较蛋白质组数据资料等。

６蛋白鉴定

一旦通过差异分析或其它方法找到感兴趣的

蛋白后，就可以从凝胶中或膜上切取这些目标蛋白质作鉴定。现在绝大多数蛋白质的鉴定是通过质谱分析来完成的。

总而言之，目前双向凝胶电泳技术尚未完善，手工操作较多，经验性强，同时双向电泳存在许多局限性，如重复性差，疏水蛋白、低表达量蛋白、极酸和极碱性蛋白、分子量较小和较大蛋白的分离还较为困难，高通量自动化尚未达到等。尽管如此，双向电泳仍然是目前分离蛋白质最有效的方法之一，广泛应用于医学领域的研究工作，如通过寻找差异蛋白质，发现疾病相关的蛋白质，寻找用于诊断的疾病相关标记分子，寻找疾病相关的蛋白质药靶，

１８１９２０２１２２２３

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