文献

　2003年10卷3期—65—

综述编译

HIV实验室检测研究进展和发展趋势

中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防与控制中心(北京100050)

魏　民综述　邵一鸣审校

[摘　要]　随着分子生物学技术的飞速发展,人类免疫缺陷病毒(HIV)的实验室检测技术也在不断更新。本

文着重阐述了HIV血清学第四代检测试剂盒的特点,应用抗体亲和力技术估计发病率,荧光实时定量PCR技术的应用以及基因芯片技术的发展趋势。

　　自从发现了人类免疫缺陷病毒(HIV)以来,人们就一直在想办法检测HIV,作为实验室诊断HIV感染的一个重要根据。断,IV体,间接地诊断IVV。近年来,,HIV的实验室检测也正发生着日新月异的变化。从聚合酶链反应(PCR)技术应用于HIV的检测,到荧光实时定量PCR的应用,再到基因芯片的应用,每一步变化,都给人们带来惊喜,都使人们对未来检测HIV的前景,以及最终控制艾滋病充满信心。现就近年来HIV实验室检测的研究进展和发展趋势综述如下。1　血清学试验1.1　血清学试验的发展

板,,,。第四代试剂,则在第三代p24抗原的检测,把HIV抗原和抗p24的抗体同时包被反应板,同

时检测血清中的HIV抗体和p24抗原,进一步缩短“窗口期”。与第三代试剂相比,第四代试剂检测窗口期大约平均缩短了4～5天。这里需要指出的是,国内外对“窗口期”的定义稍有不同,国内文献中,一般“窗口期”是指HIV感染到抗体阳转的一段时间,而英文文献中“窗口期”是指虽有HIV感染,但实验室检测为阴性的一段时间。本文采用英文文献的定义。第四代试剂已于1998年在欧洲注册使用。现在国际市场主要的第四代试剂有:VIDASHIVDUO(法国BioMerieux公司产),MurexHIVAg AbCombination(美国Abbott公司德国分部产),Enzymun2TestHIVCombi(美国Roche公司

血清学试验分为初筛和确认试验。最常用的初筛试验和确认试验分别是酶联免疫吸附试

验(ELISA)和免疫印迹试验(WB)。初筛用的第二代、第三代ELISA试剂在经过了第一代、

后,已经发展到第四代检测试剂[1～5]。1985年,美国批准使用第一代ELISA检测试剂,第一代

试剂主要以病毒裂解物或部分纯化的病毒抗原包被反应板,以检测血清中的抗体。由于包被的抗原不很纯,假阳性率较高,结果不令人满意。1990年,第二代试剂应运而生,该试剂使用基

德国分部产),EnzygnostHIVIntegral(德国

DadeBehring公司产)和Genscreen

PlusHIV

[3～5]

。Ag2Ab(美国Bio2Rad公司法国分部产)目前在美国,第四代试剂并未批准使用,不能销售,所以美国的一些公司在欧洲生产和销售第四代试剂。

第四代试剂在缩短窗口期的同时,我们也应该注意到,由于同时把抗原和抗体包被在反应板上,存在互相干扰的可能,检测的敏感性和

特异性可能都会受到影响。一般来讲,第四代试

因工程方法得到的重组抗原和合成肽包被反应

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剂检测p24抗原的敏感度(20～>100pg ml),不如单独检测p24抗原试剂的敏感度高

[3～5]

(3.5～10pg 。在Meier[6]发现的一个ml)HIV急性感染的病例中,病人有临床症状的第2、6、7、8、9、10、11、13、14天分别采血进行检测,第三代检测试剂(Genscreen,Bio2Rad)直到第13天才检测阳性,而第四代试剂(VIDASHIVDUO)第2～9天样品的检测结果全部阳

国外医学病毒学分册　

重组抗原和合成肽的。不同厂家的WB试剂相

差很大。有报告说[2]WB的特异性不是很好,只有97.8%,也就是说有大约2%的假阳性率。所以做WB之前,应先使用初筛试剂进行初筛。另外,文献报道大约4%～20%的样品经过“不确定”。相HIV初筛复检阳性后,WB结果为当数量的“不确定”样品与p24条带有关。一种

可能的解释是,病人感染了核心抗原类似的非致病逆转录病毒。尽管WB的特异性不十分令人满意,WBHIV确认试验。

HIV,、

性,说明第四代试剂检测窗口期确实缩短了。但

是,有趣的是,使用上述第四代试剂第10、11天的检测结果为阴性,直到第13天的结果才又转阳。文章中把转阴的时期,称为“第二窗口期”。“第二窗口期”存在的原因是由于急性HIV感染病人病程中,存在从血清p24抗原降低到抗体升高的时期,检测限时,发生在HIbi和

而当Weber[7]EnzygnostIV。

应用VIDASIDUOUltra和MurexHIVAg Abcombination试剂检测上述病人血清时,没有发现“第二窗口期”。VIDASHIVDUOUltra和MurexHIVAg Abcombination试剂的p24抗原检测限分别是3pg ml和5pg ml。因此,从文献报道看,使用敏感的检测试剂,可以避免“第二窗口期”的出现。这一点也提醒我们,在选择国外的第四代试剂时应如何选择。我国国内的生产厂家在研制第四代试剂时也应注意提高敏感度,避免“第二窗口期”的出现。

最近的两份第四代试剂评估论文表明

[4]

VIDASHIVDUOUltra和CobasCoreHIV

[5]

Combi与同类产品相比,具有较好的特异性

,;,朝PA(被动颗粒、斑点印迹(dotim2Determine、

unoassy)等简便快速方法。最近,美国食品和药品监督管理局(FDA)又批准了用于HIV快速检测的试剂OraQuickRapidHIV21An2

只需要tibodyTest,由美国OraSure公司生产。

一滴血,可以在20分钟内得到结果,特异性可以达到99.6%(http: www.fda.gov)。1.2　应用抗体亲和力检测技术区别新近感染

和既往感染

在流行病学上,有一个概念,称为“发病率”(incidencerate),是指一定时期内,特定人群中某病新近感染病例出现的频率。这是一个很难得到的数据,一般要经过队列研究才能得到。“发病率”中最重要的参数就是要得到新近感染的人数,而如何确定为新近感染是一个关键问题。Janssen[8]在1998年曾使用高敏感 低敏感(sensitive lesssensitive)方法检测病人血清抗体,鉴别新近感染和既往感染,来估算HIV的发病率。这种方法的原理是,新近感染病例抗体的数量、亲和力比已发病例的抗体低,因此使用高敏感的和低敏感的ELISA方法检测样品,敏感的方法(3A11,美国Abbott公司)检测阳性,而低敏感的方法(3A11,样品1:20000倍稀释,30分钟样品孵育时间,30分钟结合时间)检测阴性,则认为是新近感染(血清阳转小于6个月)。根据新近感染人数,就可以估计出HIV的

和敏感性。VIDASHIVDUOUltra试剂对于

p24抗原的检测敏感性与单独检测p24抗原试剂的敏感性相似,与第三代试剂相比,窗口期平均缩短了5.88天,特异性达到98.1%～100%。CobasCoreHIVCombi试剂与第三代

试剂相比,窗口期缩短了3.6～5.7天,特异性达到99.84%。

初筛试验阳性,需要用WB进行确认。WB有直接使用病毒裂解物作为抗原的,也有使用

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需要开盖取样电泳,加之PCR方法本身的敏感性极高,很容易导致“污染”,出现假阳性结果。另外,HIV基因的多样性,没有一套引物可以覆盖所有的HIV序列,使检测的敏感性又受到限制。上述原因,限制了PCR对于HIV感染诊断的临床应用。

最近,荧光实时PCR检测技术的应用使PCR的发展进入到一个新境界。传统的PCR是扩增以后,最后进行终点(endpoint)检测,而荧光实时PCR,则可以进行实时(realtime)检测[11,12],。其原理是:,3′,扩增时,由于荧,使荧光集团;而当PCR扩增时,引物与荧,荧光标记的探针与模板结合的位置位于上下游引物之间,利用Taq酶的5′23′外切酶活性,将荧光探针水解,荧光基团被释放出来,由于在空间上与淬灭基团的分开,则发出荧光。发出的荧光可以被荧光探头检测到,一边扩增,一边检测,这样就实现了“实时”检测。上述荧光探针,称为TaqMan探针。另外一种荧光检测方法是使用SybrGreen荧光染料,SybrGreen可以和双链DNA结合,PCR扩增得到的产物越多,则SybrGreen结合的越多,发出的荧光越强,作用和溴

发病率。在以后的应用中,发现这种方法具有重复性低、仅仅定性而非定量等缺点,甚至误把接受治疗的艾滋病人当作新近感染,而且这种方法是建立在第二代ELISA试剂的基础上,对于

(de2非B亚型检测效果不好。虽然这种方法“tuned”assay)存在许多弱点,却为后来的研究

开拓了新思路。

最近的发展则对上述方法有了进一步的改进。Parekh[9]为了使这种方法尽可能覆盖更多的亚型,把B、E、D亚型的gp41合成肽连接起来,包被反应板,这样不但可以对B、E亚型有相似的检测结果,而且对于A、C、D亚型的HIV样品也有较好的发病率估计结果。作者又进一步使用定量的方法,而不是定性的方法检测,加入尿素处理步骤,原分离等方法,i[10AbbottAxSYMHIV1 2gOassay和力指数(Avidityindex,AI),来估计新近感染(血清阳转小于6个月)和既往感染(血清阳转大于1年),AI等于HIV高亲和力的抗体 HIV总抗体,本次实验作者是以胍处理,解离低亲和力抗体,则AI=(胍

(PBS处理的样品S 处理的样品S CO比值)

CO比值)。AI值越高,说明高亲和力抗体越多,患者越接近于既往感染;AI值越低,说明低亲和力抗体越多,患者越接近于新近感染。AI取不同的界值,诊断新近感染的敏感性和特异性不同,如AI取小于0.6,敏感性和特异性分别为33.3%和98.4%;AI取小于0.9,敏感性和特异性分别为87.9%和86.3%。如何取界值,则应该根据实际情况,如果进行流行病学调查,需要高的敏感性,则应该取高界值;如果进行临床治疗,则应该取低的AI界值。2　HIV核酸检测

化乙啶类似。但是,SybrGreen染料并不能区

别开目的产物和非目的产物,使结果有偏差,特异性不如TaqMan探针好,所以现在广泛使用的是TaqMan探针技术,而不是SybrGreen方法。荧光实时PCR检测技术的应用,改变了传统的电泳终点检测,可以进行实时监控,得到非常漂亮的S型扩增曲线。不但可以进行定性检测,更重要的是可以进行定量检测。样品中待测的DNA或RNA越高,则S型扩增曲线出现的越早,若有已知拷贝数的标准品,则可以得到未知样品的拷贝数。

荧光实时PCR检测技术的应用,使得血浆病毒载量的测定方法在原来的RT2PCR、分支

核酸序列扩增系统(NAS2DNA技术(bDNA)、

自从发明了聚合酶链反应(PCR)以来,人

们就试图应用PCR技术检测HIV。传统的PCR技术通过HIV特异性引物扩增样品,电泳检测。这种方法比较简便、快速。但是,由于

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该方法可BA)基础上,又增加了一种新的方法。以检测血浆病毒载量,也可以检测血液中单个

核细胞的前病毒载量。一般来说,前病毒载量与血浆病毒载量是平行的,具有相关性[12]。但是,经过高效抗逆转录病毒(HAART)治疗后,血浆病毒载量可能检测不到,前病毒载量依然可以检测到。前病毒载量,也应该成为一个评价HAART疗法的指标。

荧光实时PCR技术,从诞生起,就得到了广泛的应用。日本红十字会使用基于这种技术的核酸检测系统(nucleicacidbygeneam2plificationtesting,NAT)同时检测乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)和HIV21,对于献血

国外医学病毒学分册　

好,但对非B亚型的耐药性检测存在漏检和错检[17]。

虽然基因芯片技术尚需要进一步完善,但

是可以预见,在未来的几年里,其应用前景是好的。不仅可用于HIV的耐药性检测,用于HIV的基因诊断,甚至可以把许多致病病原体的基因集中在一张芯片上,用一张小小的芯片就可以同时对许多微生物的感染进行诊断。这不是梦想,将成为不久的现实[18]。

综上所述,两个方面对HIV述。H。HIV、敏感、准确、自动化,会有更多的新技术被应用到这一领域。

参考文献

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员进行筛查,以弥补抗体筛查对处于HIV感染

窗口期出现的漏检。从2000年2月12001年4月30日,学检查阴性的,发HBVDNA例RNA阳性标本和

[13]

4例HIV21。这也提示我们,仅仅使用血清学方法筛查样品,会有一定的漏检,进行血液的NAT检测是非常必要的。目前,我国的荧光PCR检测技术已经赶上,2002年4月国家药品监督管理局(SDA)批准了第一个HIV荧光PCR检测试剂盒,由深圳匹基公司生产。

3　基因芯片技术的应用

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基因芯片技术是近些年发展起来的

新兴的生物技术,是指将许多特定的寡核苷酸片段作为探针,有规律地排列于固相支持物上,然后与待测的标记样品的基因进行杂交,再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描,并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较和检测,从而迅速得出所要的信息。基因芯片技术以其高通量、快速检测的特点,在基因表达、肿瘤诊断、遗传病诊断、基因分型等诸多领域得以广泛应用。在HIV检测方面,Affymetrix公司开发出GeneChipHIVPRT440芯片,用于抗HIV逆转录酶和蛋白酶药物的耐药性分析[16,17]。对B亚型的检测结果很

[14,15]

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呼吸道感染的病毒学检测

朱关福

1　影响检测的因素1.1　解剖生理学特点

3～5,,细胞形态,;由于合适人胚难得,2代的人胚肾二倍体细胞;为减少

。如人胚肾细胞实在难得,也可试用确切无污染的Vero细胞。检测呼吸道感染的标本主要是咽拭子、咽漱液及痰,这些标本在接种细胞培养前要先经除菌处理;有些标本对细胞可能有毒性作用,在接种细胞培养后要勤于镜检,如发现细胞有可疑毒性现象,要立即换液,必要时换液后加入正常细胞,以保证细胞培养顺利进行。如何判别细胞培养中是否存在病毒,最简便的指标是镜检有无细胞病变(CPE);如未见到明显细胞病变,可作敏感的血细胞吸附试验,常用豚鼠及公鸡混合红血细胞、粘病毒、副粘病毒、鼻病毒及冠状病毒等皆可能呈现阳性反应,血红细胞主要粘附在有病毒的细胞上,因此也有利于判别可疑的细胞病变;如血细胞吸附试验阴性,可作干扰试验,如试验阳性,就可初步认为有病毒存在。此外,也可检查培养物中是否存在病毒抗原(常用ELISA)或病毒核酸(常用核酸杂交试验及PCR),需要关注的是许多呼吸道感染病毒是SS(+)RNA,它本身就起mRNA作用,这种核

呼吸道是人体中开放性器官,内外基本上相通,染,,相继感染,,这对病原诊断带来很大困扰1.2　流行病学特点

呼吸道感染主要是通过气溶胶空气传播,有的仅需吸入少量病毒就可引起感染,有的要通过密切接触吸入多量病毒才会引起感染;不论那种要求,感染的扩散是比较容易的,因此不进行及时的防制就可能发生流行;对从事烈性病毒的诊治工作,必需有相应的安全措施,否则不仅累及有关工作人员,还要波及广大群众,这是需要十分警惕关注。2　检测方法概述2.1　分离病毒

这是病原诊断中的王牌,不仅可能获得病原体,还有希望发现新病毒。目前常用的方法是组织培养,包括细胞培养及器官培养。培养条件均需采用旋转培养以增加通气量,培养温度对上感宜用33～35℃,对下感宜用35～37℃,培养液要稍偏酸,以pH618±011为宜;必需设置正常组织培养对照,以保证判别结果的可靠性。2.1.1　细胞培养

酸是有感染性,不宜在一般实验室中操作,需有防护措施。如细胞培养接种标本后未查出病毒,有可能是病毒量少难以检出,为此要进行盲传,

盲传时要混合原代培养物及冻融(速冻慢融)原代培养物以提高检出阳性率;盲传二代仍呈阴

最适宜的细胞是原代人胚肾细胞,需要用