淋巴细胞分离与培养

淋巴细胞分离与培养

淋巴细胞分离与培养技术

淋巴细胞分离与培养

淋巴细胞作为血液中白血胞的主要组成 成分，是动物机体完成细胞免疫和体液 免疫的重要基础，为抵抗外来侵害提供 了完善的免疫防护机制。同时，淋巴细 胞还具有寿命长，激活后可分裂、增殖 的特性，因此很适合于离体培养，为免 疫学研究带来极大的方便。另外，利用 体外培养的淋巴细胞进行抗癌研究、爱 滋病治疗、新药研制已屡见不鲜。

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一、淋巴细胞分离 1、分离原理 人淋巴细胞的方便来源是外周血，分离 的原则是收率较高，纯度较好，失活较 低，根据不同试验有相对纯度，无论采 用哪种方法，应尽最大可能保持细胞应 有活性。分离的技术可根据细胞的物理 性状和表面标志设计。

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密度梯度离心法 其原理是：人外周血中各种细胞的密度不同， 人红细胞密度为1.093,粒细胞为1.092,淋 巴细胞为1.074±0.001。密度梯度离心法的 原理主要根据各类血细胞比重的差异，利用比 重介于某两类细胞之间的细胞分离液对血液离 心，使一定比重的血细胞依相应的密度梯度分 布于不同的独立带，从而达到分离的目的。

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2、方法 (1).采静脉血2ml 加入肝素抗凝管 (2).用竹签将血块轻轻剥离管壁(主张用 玻璃棒),2000rPm 离心20 分钟，用毛 细吸管吸取上清(血清)于血清收集管中， 于4℃冰箱保存备用，

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3.将装有静脉血2ml 加入肝素抗凝管(或枸 橼酸钠)轻轻摇动使血液与抗凝剂混匀，出现 凝集不能继续实验。5min 后加入Hank's 液 2ml(Hank's 液为缓冲等渗液，类似营养液， 保持细胞活性及完整性，可抵抗轻微的酸碱变 化),手动轻轻摇匀。 4.用毛细吸管吸取抗凝血，将抗凝血全部沿 管壁缓慢加至另一含2ml 淋巴细胞分离液液面 上，注意保持两种液体界面清晰。

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5.将试管平衡后置水平式离心机， 2000rpm 离心10min。 6.用毛细吸管仔细吸取血浆与分层液界面 处淋巴细胞层至一刻度离心管内。 7.加入Hank's 液5ml,手动旋转试管使 液体混匀，2000rpm 离心10min,弃上 清，沉淀即主要为淋巴细胞。 备注：如做淋巴细胞转化或其它培养，所 用试剂、器材应是无菌的。

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【难点】 1.将抗凝血与Hank‘s 液的混合液加入 淋巴细胞分离液时，必须保持两种液体 界面清晰。 2.用毛细吸管吸取淋巴细胞层时，要掌 握好力度，在细胞层上作各个方向的吸 取，勿吸到其它层的液体或细胞，吸取 时勿使各层细胞相混。

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二、淋巴细胞培养 1、原理 通常情况下哺乳动物外周血中是没有分裂细胞 的，只有在异常情况下才能发现。外周血中的 小淋巴细胞几乎都处于G1期或G0期的非增

殖 状态。体外培养时经一定剂量的植物血凝素 (PHA)刺激，T淋巴细胞可转变为淋巴母细 胞，重新进入增殖周期，进行有丝分裂。外周 血中的淋巴细胞经过68-72小时(三个周期) 的短期培养，即可产生大量的增殖期细胞群。

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2、实验准备 1. 实验器材： 超净工作台、37℃恒温培养箱、酒精灯、无菌注射器 (1ml、2ml、5m1)、针头、培养瓶、橡皮塞、75% 酒精棉球、止血带、离心机、定时钟、试管架、 手术镊 子 2.实验材料： 人外周静脉血(肝素抗凝) 3.试剂 抗凝剂：肝素溶液(500U/ml) 培养基：RPMI1640, 按照说明书配制后抽滤、分装， 冻存备用。 小牛血清：市售，冰冻保存，用时在56℃水浴条件灭 活。 植物血球凝集素(PHA):市售，按说明书要求使用 抗菌素：青霉素：50000U/ml,链霉素： 50000ug/ml,均用无菌生理盐水配制。培养液中的终 浓度均为100 U/ml 5%NaHCO3

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3、实验步骤 (1)培养液配制(在超静工作台内无菌操作); 每个培养瓶(容积30ml)中加入5ml培养液， 其中含： RPMI1640 4ml 灭活小牛血清 1ml PHA 2.5mg 青霉素 500U 链霉素 500ug 依次将上述试剂加入培养瓶中，反复吹打使其混 合均匀，用5%NaHCO3调节培养基的pH值至 7.2-7.4。

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(2)血样本的采集：先以碘酒和75%乙 醇消毒皮肤。用2ml灭菌注射器吸取约 0.2ml肝素,作静脉穿刺，抽取外周静脉血 1ml。转动针筒以混匀肝素 (3)接种：常规消毒后，立即将针头插入 灭菌小瓶内，送入超净工作台 ，在火焰旁 将血液滴入2~3个盛有5ml培养液的培养 瓶内，每瓶0.2~0.3ml(6号针头45度倾 斜，约20滴),盖上橡皮塞，轻轻摇动以 混匀。贴好标签，将培养瓶放在37℃恒温 箱内静置培养72h。

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4、注意事项 (1)pH 值 细胞生长的最适pH 为7. 0~7. 2 ,可忍耐 的pH 范围为6. 6~7. 8 ,当pH 低于6. 8 或大于7. 6 时, 都会抑制细胞生长 。 RPMI1640 培养基加入血清后pH 值一般 升高0. 2~0.4 ,故配1640 培养液及其他 用液时使pH 值达到7. 2比较合适,并且需 经常检测pH 值。

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(2)培养空间 培养液与液面上的空间二者的体积比例 一般以1∶10 为宜,培养液液面高度最好 维持在2~5mm 的范围,以便于气体交 换。 (3)恒温 …… 此处隐藏：459字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……