实验七 动物组织DNA的提取

实验七 真核生物组织中 DNA的提取 总DNA的提取Total DNA extraction from eukaryotic tissue

实验目的了解真核生物基因组DNA提取的一般原理 了解真核生物基因组DNA提取的一般原理 通过动物组织DNA的提取，掌握DNA 通过动物组织DNA的提取，掌握DNA 提取 的方法和步骤

高等动物、植物的基因组相当宠大， 高等动物、植物的基因组相当宠大， 如人类细胞基 因组由30亿个碱基对组成， 包含了该物种生长， 因组由30亿个碱基对组成， 包含了该物种生长 ，发 育，繁殖等各项生理活动的几乎全部信息量，获得 繁殖等各项生理活动的几乎全部信息量， 纯度高、 基因组相对完整的基因组是以后 PCR分析 ， 纯度高 、 基因组相对完整的基因组是以后PCR 分析， 基因文库的构建，基因探测等的研究的基础。 基因文库的构建，基因探测等的研究的基础。 动物细胞基因组在提取过程中一般有以下几步: 动物细胞基因组在提取过程中一般有以下几步: 首先是机械法破细胞抽提； 然后去除蛋白质，糖类等细胞内杂质污染； 最后纯化出DNA。

DNA提取原则 DNA提取原则保证DNA结构的完整性 保证DNA结构的完整性纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质

排除有机溶剂和金属离子的污染 蛋白质、多糖、酚类等降低到最低程度 排除其他核酸分子的污染

实验原理DNA与蛋白质结合成脱氧核糖蛋白(DNP),能 DNA与蛋白质结合成脱氧核糖蛋白(DNP),能 溶解在纯水或1mol/L的NaCl溶液中，而不溶于有 溶解在纯水或1mol/L的NaCl溶液中，而不溶于有 机溶剂。

SDS法提取动物组织 SDS法提取动物组织DNA 法提取动物组织DNASDS(十二烷基硫酸钠 SDS(十二烷基硫酸钠 )是阴离子表面活性剂，溶 解膜蛋白而破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉淀下来。 EDTA 抑制DNA酶的活性。再加入氯仿等有机溶剂， 抑制DNA酶的活性。再加入氯仿等有机溶剂 再加入氯仿等有机溶剂， 能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA (DNA、 能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、 RNA)水溶性很强 水溶性很强， RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细 胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入乙醇 乙醇使 胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入乙醇使DNA 沉淀，沉淀DNA溶于双蒸水或TE溶液中， DNA溶液 DNA溶于双蒸水或TE溶液中 溶液。 沉淀，沉淀DNA溶于双蒸水或TE溶液中，即DNA溶液。

试剂提取缓冲液： 提取缓冲液：200 mmol/L Tris·Cl (pH8.0), 25mmol/L EDTA, 500 mmol/L NaCl, 0.5% SDS 24:1的氯仿：异戊醇 的氯仿： : 的氯仿 预冷无水乙醇

SDS抽提液配方 SDS抽提液配方(1000ml): 抽提液配方(1000ml):

操作步骤1. 肝脏 左右, (剪碎 置研

钵中，加入 肝脏1g左右 剪碎 置研钵中，加入1-2mL提取缓冲 左右 剪碎) 提取缓冲 研磨成浆； 管中， 液， 研磨成浆；倒入10mL EP管中，摇动混匀； 管中 摇动混匀； 2. 60℃水浴保温 颠倒混匀； ℃水浴保温30-60min,不时颠倒混匀； ,不时颠倒混匀 3. 室温下 室温下3000rpm离心 离心10min; 离心 ； 4. 小心吸上清于新的 小心吸上清于新的10mL EP管中，加入等体积的 管中， 管中 加入等体积的 24:1的氯仿：异戊醇，上下颠倒混匀； 的氯仿：异戊醇，上下颠倒混匀； 5. 室温下 室温下3000rpm离心 离心10min; 离心 ； 6. 小心将上层水相吸入新的 小心将上层水相吸入新的10mL EP管中； 将上层水相吸入新的 管中； 管中 7. 重复 步2-3次; (此步不做) 重复4-5步 次 此步不做 此步不做) 8. 加入 倍体积预冷无水乙醇，室温下放置片刻即 加入1-2倍体积预冷无水乙醇， 倍体积预冷无水乙醇 出现絮状DNA沉淀。 沉淀。 出现絮状 沉淀

结果分析与讨论