第5卷第4期 过 程 工 程 学 报 Vol.5 No.4 2005 年 8 月 The Chinese Journal of Process Engineering Aug. 2005

添加羟胺诱导Streptomyces hygroscopicus产谷氨酰胺转胺酶

张程杰, 堵国成, 李 寅, 陈 坚

(江南大学工业生物技术教育部重点实验室，生物工程学院环境生物技术研究室，江苏 无锡 214036)

摘 要：研究了添加羟胺对Streptomyces hygroscopicus合成谷氨酰胺转胺酶的影响. 结果表明，添加羟胺可诱导谷氨酰胺转胺酶的合成. 摇瓶培养过程中，羟胺的最适添加量和最适添加时间分别为0.5 mmol/L和38 h，发酵结束时，谷氨酰胺转胺酶酶活最高达到5.3 U/mL，比对照提高了32.5%. 添加羟胺可诱导Streptomyces hygroscopicus产酶，羟胺与谷氨酰胺转胺酶反应的结果是产生了L 谷氨酸 γ 单羟肟酸，实验证明它对Streptomyces hygroscopicus产酶有抑制作用. 诱导产酶过程是羟胺的促进作用和L 谷氨酸 γ 单羟肟酸的抑制作用逐步达到平衡、最后酶活趋于稳定的过程. 关键词：谷氨酰胺转胺酶；微生物谷氨酰胺转胺酶；Streptomyces hygroscopicus；羟胺；诱导物 中图分类号：Q814 文献标识码：A 文章编号：1009 606X(2005)04 0434 04

1 前 言

微生物谷氨酰胺转胺酶(蛋白质 谷氨酸 γ谷氨酰胺转移酶，Microbial Transglutaminase EC 2.3.2.13, MTG)可以催化蛋白质分子内的交联、分子间的交联、蛋白质和氨基酸之间的连接以及蛋白质分子内谷氨酰胺酰胺基的水解，从而改善各种蛋白质的功能性质，如：营养价值、质地结构、口感、贮存期等，因此在食品工业上商业化谷氨酰胺转胺酶主要从应用较为广泛[1 3]. 目前，

动物组织中提取，但由于其分离和纯化过程较复杂，且来源稀少，因而价格昂贵[4].

随着市场需求的增加，工业化产谷氨酰胺转胺酶对低成本高产量的要求越来越迫切，人们开始转向于研究利用微生物发酵来生产谷氨酰胺转胺酶. 20世纪80年代末，Ando等[2]和Motoki等[5]首先报道了利用微生物发酵法生产谷氨酰胺转胺酶的结果. Junqua等[6]用Streptoverticillium cinnamoneum CBS 683.68为菌种优化培养基，摇瓶条件下MTG的发酵水平达到(0.331±0.038) U/mL. 近年来以应用最广泛的Streptoverticillium mobaraense为菌种，Zhu等[7,8]通过化学计算法对培养基进行分析设计，在摇瓶条件下使MTG的发酵水平达到pH1.8 U/mL. Zheng等[9 11]通过在发酵过程中控制温度、等参数，在2.5 L发酵罐中MTG平均酶活为2.94 U/mL，最高达到3.37 U/mL. 作者所在实验室在2003年筛选出一株新的产谷氨酰胺转胺酶的菌株Streptomyces hygroscopicus，并对其发酵条件进行了优化

[12]

并分析了羟胺的诱导作用. 使用廉价诱导物提高酶产量，为降低其生产成本进行了有益的探索.

2 材料与方法

2.1 菌种

吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus) CCTCC

M203062，系本研究室从土壤中筛选得到，已申请国家专利.

2.2 培养基和培养条件

培养基和培养条件参照文献[12]，发酵培养在500 mL三角瓶中进行. 2.3 羟胺添加实验

在发酵10, 24, 32, 36, 38和40 h时分别添加羟胺，将羟胺分别配成浓度为5, 15, 25, 35, 45和50 mmol/L的标准溶液，分别取1 mL羟胺溶液加入发酵液(49 mL)，使发酵液中羟胺的浓度分别达到0.1, 0.3, 0.5, 0.7和0.9 mmol/L. 其他发酵条件不变. 2.4 L-谷氨酸-γ-单羟肟酸添加实验

在发酵38 h时分别添加不同浓度的L 谷氨酸 γ 单羟肟酸，将其分别配成浓度为5, 10, 15, 20, 25和50 mmol/L的标准溶液，分别取1 mL加入发酵液，使发酵液中L 谷氨酸 γ 单羟肟酸的浓度分别达到0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5和1.0 mmol/L, 48 h后发酵结束分别测酶活. 2.5 主要试剂

Nα CBZ GLN GLY(Nalpha Carbobenzyloxy Glutamine Glycine)和L 谷氨酸 γ 单羟胺酸(HCA)由Sigma公司提供，三羟甲基氨基甲烷(Tris)由上海化学试剂厂提供，盐酸羟胺、谷胱甘肽(还原型)、天冬酰胺和谷氨酰胺、8 羟基喹啉由华美生物工程公司提供.

.

在各种微生物生产谷氨酰胺转胺酶的发酵法中，使用诱导物来提高酶产量还鲜有报道. 在本研究中，通过在发酵过程中添加羟胺提高了谷氨酰胺转胺酶的产量，

收稿日期：2004 08 19，修回日期：2004 10 18 基金项目：国家十五攻关基金资助项目(编号：2001BA708B030 5)；教育部青年骨干教师基金资助项目；江苏省十五攻关基金资助项目(编号：BE2002018) 作者简介：张程杰(1980 )，男，四川省乐山市人，硕士研究生，发酵工程专业；陈坚，通讯联系人，E-mail: jchen@http://www.77cn.com.cn.

第4期 张程杰等：添加羟胺诱导Streptomyces hygroscopicus产谷氨酰胺转胺酶 435

2.6 分析方法

2.6.1 菌体细胞生长量测定

取发酵液5 mL, 10000 r/min离心10 min，蒸馏水水洗2次，105℃干燥至恒重后称重. 2.6.2 谷氨酰胺转胺酶酶活测定

比色法[13]测定酶活：Nα CBZ GLN GLY为作用底物，以L 谷氨酸 γ 单羟肟酸作标准曲线. 1个单位谷氨酰胺转胺酶酶活定义为37℃时催化形成1 μmol/min L 谷氨酸 γ 单羟肟酸的酶量(U/mL). 2.6.3 羟胺测定

羟基喹啉光度法[14].

2.6.4 L 谷氨酸 γ 单羟肟酸浓度的测定

不同浓度梯度的L 谷氨酸 γ 单羟肟酸标准溶液1 mL, 加0.4 mL试剂B(3 mol/L HCl, 12%三氯苯甲醚，5% FeCl3, 按1:1:1混合), 37℃保温10 min，

在525 nm测吸光度作标准曲线 …… 此处隐藏：7664字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……