第5卷第4期 过 程 工 程 学 报 Vol.5 No.4 2005 年 8 月 The Chinese Journal of Process Engineering Aug. 2005

添加羟胺诱导Streptomyces hygroscopicus产谷氨酰胺转胺酶

张程杰, 堵国成, 李 寅, 陈 坚

(江南大学工业生物技术教育部重点实验室，生物工程学院环境生物技术研究室，江苏 无锡 214036)

摘 要：研究了添加羟胺对Streptomyces hygroscopicus合成谷氨酰胺转胺酶的影响. 结果表明，添加羟胺可诱导谷氨酰胺转胺酶的合成. 摇瓶培养过程中，羟胺的最适添加量和最适添加时间分别为0.5 mmol/L和38 h，发酵结束时，谷氨酰胺转胺酶酶活最高达到5.3 U/mL，比对照提高了32.5%. 添加羟胺可诱导Streptomyces hygroscopicus产酶，羟胺与谷氨酰胺转胺酶反应的结果是产生了L 谷氨酸 γ 单羟肟酸，实验证明它对Streptomyces hygroscopicus产酶有抑制作用. 诱导产酶过程是羟胺的促进作用和L 谷氨酸 γ 单羟肟酸的抑制作用逐步达到平衡、最后酶活趋于稳定的过程. 关键词：谷氨酰胺转胺酶；微生物谷氨酰胺转胺酶；Streptomyces hygroscopicus；羟胺；诱导物 中图分类号：Q814 文献标识码：A 文章编号：1009 606X(2005)04 0434 04

1 前 言

微生物谷氨酰胺转胺酶(蛋白质 谷氨酸 γ谷氨酰胺转移酶，Microbial Transglutaminase EC 2.3.2.13, MTG)可以催化蛋白质分子内的交联、分子间的交联、蛋白质和氨基酸之间的连接以及蛋白质分子内谷氨酰胺酰胺基的水解，从而改善各种蛋白质的功能性质，如：营养价值、质地结构、口感、贮存期等，因此在食品工业上商业化谷氨酰胺转胺酶主要从应用较为广泛[1 3]. 目前，

动物组织中提取，但由于其分离和纯化过程较复杂，且来源稀少，因而价格昂贵[4].

随着市场需求的增加，工业化产谷氨酰胺转胺酶对低成本高产量的要求越来越迫切，人们开始转向于研究利用微生物发酵来生产谷氨酰胺转胺酶. 20世纪80年代末，Ando等[2]和Motoki等[5]首先报道了利用微生物发酵法生产谷氨酰胺转胺酶的结果. Junqua等[6]用Streptoverticillium cinnamoneum CBS 683.68为菌种优化培养基，摇瓶条件下MTG的发酵水平达到(0.331±0.038) U/mL. 近年来以应用最广泛的Streptoverticillium mobaraense为菌种，Zhu等[7,8]通过化学计算法对培养基进行分析设计，在摇瓶条件下使MTG的发酵水平达到pH1.8 U/mL. Zheng等[9 11]通过在发酵过程中控制温度、等参数，在2.5 L发酵罐中MTG平均酶活为2.94 U/mL，最高达到3.37 U/mL. 作者所在实验室在2003年筛选出一株新的产谷氨酰胺转胺酶的菌株Streptomyces hygroscopicus，并对其发酵条件进行了优化

[12]

并分析了羟胺的诱导作用. 使用廉价诱导物提高酶产量，为降低其生产成本进行了有益的探索.

2 材料与方法

2.1 菌种

吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus) CCTCC

M203062，系本研究室从土壤中筛选得到，已申请国家专利.

2.2 培养基和培养条件

培养基和培养条件参照文献[12]，发酵培养在500 mL三角瓶中进行. 2.3 羟胺添加实验

在发酵10, 24, 32, 36, 38和40 h时分别添加羟胺，将羟胺分别配成浓度为5, 15, 25, 35, 45和50 mmol/L的标准溶液，分别取1 mL羟胺溶液加入发酵液(49 mL)，使发酵液中羟胺的浓度分别达到0.1, 0.3, 0.5, 0.7和0.9 mmol/L. 其他发酵条件不变. 2.4 L-谷氨酸-γ-单羟肟酸添加实验

在发酵38 h时分别添加不同浓度的L 谷氨酸 γ 单羟肟酸，将其分别配成浓度为5, 10, 15, 20, 25和50 mmol/L的标准溶液，分别取1 mL加入发酵液，使发酵液中L 谷氨酸 γ 单羟肟酸的浓度分别达到0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5和1.0 mmol/L, 48 h后发酵结束分别测酶活. 2.5 主要试剂

Nα CBZ GLN GLY(Nalpha Carbobenzyloxy Glutamine Glycine)和L 谷氨酸 γ 单羟胺酸(HCA)由Sigma公司提供，三羟甲基氨基甲烷(Tris)由上海化学试剂厂提供，盐酸羟胺、谷胱甘肽(还原型)、天冬酰胺和谷氨酰胺、8 羟基喹啉由华美生物工程公司提供.

.

在各种微生物生产谷氨酰胺转胺酶的发酵法中，使用诱导物来提高酶产量还鲜有报道. 在本研究中，通过在发酵过程中添加羟胺提高了谷氨酰胺转胺酶的产量，

收稿日期：2004 08 19，修回日期：2004 10 18 基金项目：国家十五攻关基金资助项目(编号：2001BA708B030 5)；教育部青年骨干教师基金资助项目；江苏省十五攻关基金资助项目(编号：BE2002018) 作者简介：张程杰(1980 )，男，四川省乐山市人，硕士研究生，发酵工程专业；陈坚，通讯联系人，E-mail: jchen@http://www.77cn.com.cn.

第4期 张程杰等：添加羟胺诱导Streptomyces hygroscopicus产谷氨酰胺转胺酶 435

2.6 分析方法

2.6.1 菌体细胞生长量测定

取发酵液5 mL, 10000 r/min离心10 min，蒸馏水水洗2次，105℃干燥至恒重后称重. 2.6.2 谷氨酰胺转胺酶酶活测定

比色法[13]测定酶活：Nα CBZ GLN GLY为作用底物，以L 谷氨酸 γ 单羟肟酸作标准曲线. 1个单位谷氨酰胺转胺酶酶活定义为37℃时催化形成1 μmol/min L 谷氨酸 γ 单羟肟酸的酶量(U/mL). 2.6.3 羟胺测定

羟基喹啉光度法[14].

2.6.4 L 谷氨酸 γ 单羟肟酸浓度的测定

不同浓度梯度的L 谷氨酸 γ 单羟肟酸标准溶液1 mL, 加0.4 mL试剂B(3 mol/L HCl, 12%三氯苯甲醚，5% FeCl3, 按1:1:1混合), 37℃保温10 min，

在525 nm测吸光度作标准曲线. 取 1 mL发酵上清液，加入0.4 mL试剂B，37℃保温10 min，在525 nm测吸光度，根据标准曲线计算L 谷氨酸 γ 单羟肟酸的浓度.

3 结果与讨论

3.1 羟胺的添加时间

发酵起始时，在培养基中添加不同浓度的羟胺(0～8 mmol/L)，发现羟胺对菌体生长和产酶均有明显的抑制作用，且随羟胺添加量的增大而显著增加. 由图1可见，发酵初期培养基中羟胺浓度达2 mmol/L时，菌体的生长会受到严重的抑制，酶的合成量也非常小. 此结果表明，羟胺不适合在发酵初期添加.

530

)

L 4

m/U ( 320)

tyiv L/gitca 2( WGCTM 110D 0

2

4

6

8

Hydroxylamine (mmol/L)

图1 发酵初期羟胺添加对产酶的影响

Fig.1 Effect of initial hydroxylamine addition on MTG

production

从图2所示的谷氨酰胺转胺酶发酵过程曲线可以看出，菌体的生长在24 h后进入稳定期，而谷氨酰胺转胺酶的合成在32 h左右进入稳定期.

30

4)

Lm/ 3

20

U()

L/tyiv2g(10

itc Wa CGT 1DM 0 0

8

16

24

32

40

48

Time (h)

图2 MTG发酵过程曲线

Fig.2 Profiles of fermentation

为了确定在发酵过程的不同时期添加不同浓度的羟胺对产酶的影响，分别在发酵10, 24, 32, 36, 38和40 h时添加羟胺. 考虑到浓度为1 mmol/L的羟胺在初始条件下对产酶仍然不利，所以使发酵液中羟胺的浓度更低一些，分别达到0.1, 0.3, 0.5, 0.7和0.9 mmol/L，以不添加羟胺作为对照. 实验结果显示，在发酵36 h前添加不同浓度的羟胺，对产酶几乎没有影响(数据未列出)，而分别在36, 38及40 h添加羟胺时，会显著影响谷氨酰胺转胺酶的合成，结果如图3所示. 从图可以看出，在38 h添加0.5 mmol/L羟胺，或在36及40 h添加0.3 mmol/L羟胺，发酵48 h后测酶活，分别可以获得最高的酶活水平，其中在38 h添加0.5 mmol/L羟胺时，谷氨酰胺转胺酶酶活可达到最大值5.3 U/mL，比对照提高了32.5%. 这3组实验中，菌体的生长量没有受到添加羟胺的影响，细胞干重均在25 g/L左右. 3.2 羟胺的转化和作用机理

取38 h的发酵液，加热10 min以杀死细胞及灭酶，加入羟胺，使其浓度达0.5 mmol/L，继续培养6 h后，液体中羟胺残留浓度为0.47 mmol/L，表明当培养液中没有活细胞及谷氨酰胺转胺酶存在时，羟胺基本没有被消耗. 而直接在培养38 h的正常发酵液中添加等量(0.5 mmol/L)的羟胺，继续培养1 h时后，羟胺被完全消耗，同时产生了0.46 mmol/L的L 谷氨酸 γ 单羟肟酸，且其生成的量与羟胺消耗的量呈对应关系，表明系统中羟胺被转化为L 谷氨酸 γ 单羟肟酸(如图4所示). 取培养38 h的正常发酵液过滤去除菌体而保留其中的酶活，加入0.5 mmol/L的羟胺，发现羟胺也会被消耗，有L 谷氨酸 γ 单羟肟酸生成.

实验结果表明，羟胺在没有活菌体及谷氨酰胺转胺酶存在的条件下，在发酵体系中几乎不参加任何反应. 而只要有谷氨酰胺转胺酶存在时，羟胺会很快被转化成L 谷氨酸 γ 单羟肟酸.

436 过 程 工 程 学 报 第5卷

MTG activity (U/mL)

5.5

(a) Addition time 36 h

(b) Addition time 38 h

(c) Addition time 40 h

5.04.54.03.53.0

0 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9Hydroxylaimne (mmol/L)

0 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9Hydroxylaimne (mmol/L)

0 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9

Hydroxylamine (mmol/L)

图3 羟胺的添加时间和浓度对产酶的影响

Fig.3 Effects of different hydroxylamine addition times and concentrations on MTG

Hydroxylamine (mmol/L)

0.50.40.30.20.10.0

38

39

40

41Time (h)

42

43

44

L-glutamic acid-γ-monohydroxamate (mmol/L)

MTG activity (U/mL)

3.53.02.52.01.5

0.50.40.30.20.10.0

L-glutamic acid-γ-monohydroxamate (mmol/L)

图4 发酵液中羟胺的消耗与L 谷氨酸 γ 单羟肟酸生成

Fig.4 Comsumption of hydroxylamine and formation of L-glutamic

acid γ-monohydroxamate in broth dealed with different ways 图5 L 谷氨酸 γ 单羟肟酸对产酶的影响

Fig.5 Effect of L-glutamic acid γ-monohydroxamate on MTG

production

在发酵38 h时添加不同量的L 谷氨酸 γ 单羟肟酸，研究其对谷氨酰胺转胺酶合成的影响，结果如图5所示. 表明添加不同浓度的L 谷氨酸 γ 单羟肟酸对产酶都有抑制作用，且随着添加浓度的增加抑制作用愈明显. 添加L 谷氨酸 γ 单羟肟酸的浓度为0.5 mmol/L时，发酵酶活降低了35%，添加浓度为1 mmol/L时，发酵酶活降低了47%.

图5表明在发酵液中直接添加L 谷氨酸 γ 单羟肟酸能明显抑制MTG的酶活，而正常发酵液中添加0.5 mmol/L的羟胺能产生0.4 mmol/L的L 谷氨酸 γ 单羟肟酸，却对酶活有诱导作用. 这说明是羟胺而不是L 谷氨酸 γ 单羟肟酸对Streptomycin hygroscopicus的产酶有诱导作用. 适量的羟胺存在于已经产酶的Streptomycin hygroscopicus发酵液中，诱导作用就开始了. 在培养38 h的正常发酵液中添加羟胺，羟胺和酶活在1 h内的变化如图6所示. 表明在此过程中，一方面羟胺与产酶系统作用而消耗，另一方面谷氨酰胺转胺酶的酶活相应地得到了提高. 随着反应产物L 谷氨酸 γ 单羟肟酸的浓度逐步提高，它对产酶的抑制作用也逐步

加强，最后酶活趋于稳定. 在发酵液中直接添加L 谷氨酸 γ 单羟肟酸对微生物的产酶系统不会形成诱导和抑制的平衡，对产酶会有抑制作用.

Hydroxylamine,

L-glutamic acid-γ-monohy-droxamate (mmol/L)

5.5

0.5

MTG activity (U/mL)

0.40.30.20.10.0

38.0

38.2

38.4

38.6Time (h)

38.8

39.0

39.2

3.5

5.0

4.5

4.0

图6 38~39 h羟胺、L 谷氨酸 γ 单羟肟酸和酶活的变化 Fig.6 Profiles of hydroxylamine, L-glutamic acid γ-monohy-

droxamate and MTG activity between 38～39 h

3.3 多次添加羟胺

图4表明，羟胺在发酵液中1 h就消耗用尽，设想

第4期 张程杰等：添加羟胺诱导Streptomyces hygroscopicus产谷氨酰胺转胺酶 437

添加羟胺会有更好的产酶效果，但实验结果表明，多次添加羟胺对产酶的效果影响并不明显(数据未列出).

[5] Motoki M, Kiyama A, Nonaka M, et al. Novel Transglutaminase

Manufacture for Preparation of Protein Gelling Compounds [P]. Japan Pat.: JP 0217471, 1989 01 27.

[6] Junqua M, Duran R, Gancet C, et al. Optimization of Microbial

Transglutaminase Production Using Experimental Designs [J]. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1997, 48: 730 734.

[7] Zhu Y, Rinzema A, Tramper J. Medium Design Based on

Stoiciometric Analysis of Microbial Transglutaminase Production by Streptoverticillium mobarense [J]. Biotechnol. Bioeng., 1996, 50: 291 298.

[8] Zhu Y, Rinzema A, Tramper J. Fed-batch Fermentation Dealing with

Nitrogen Limitation in Microbial Transglutaminase Production by Streptoverticillium mobaraense [J]. Appl. Microb. Biotechnol., 1998, 49: 251 257.

[9] Zheng M Y, Du G C, Chen J, et al. A Temperature-shift Strategy in

Batch Microbial Transglutaminase Fermentation [J]. Process Biochem., 2001, 36: 525 530.

[10] Zheng M Y, Du G C, Chen J. Modeling of Temperature Effects on

Batch Microbial Transglutaminase Fermentation with Streptoverticillium mobaraense [J]. World J. Microbiol. Biotechnol., 2002, 18: 767 771.

[11] Zheng M Y, Du G C, Chen J. pH Control Strategy of Batch Microbial

Transglutaminase Production with Streptoverticillium mobaraense [J]. Enzyme Microb. Technol., 2002, 31(4): 477 481.

[12] 柏映国，堵国成，陈坚，等. Streptomyces hygroscopicus产谷氨酰

胺转胺酶摇瓶发酵条件的优化 [J]. 食品与发酵工业, 2004, 30(2): 27 32.

[13] Grossowicz N, Wainfan E, Borek E. The Enzymatic Formation of

Hydroxamic Acids from Glutamine and Asparagines []. J. Biol. Chem., 1950, 187: 111 125.

[14] Frear D S, Burrel R C. Spectrophotometer Method for Determining

Hydroxylamine Reductase Activity in Higher Plants [J]. Anal. Chem., 1955, 27: 1664 1665.

4 结 论

(1) 羟胺可以在发酵过程中被迅速消耗，添加羟胺促进产酶的工艺在工业生产中具有实际意义.

(2) 羟胺的最适添加时间在发酵后期. 羟胺和L 谷氨酸 γ 单羟肟酸的相互作用机理及与菌体生理状态的关系有待进一步研究.

(3) 系统中诱导物的存在能使酶提前处于工作状态，使其“产酶工厂”也处于兴奋状态，从而促进产酶. 与添加羟胺诱导产谷氨酰胺转胺酶一样，对于其他生产胞外酶的发酵过程，加入一些酶的可能作用底物可以达到促进产酶的效果. 添加诱导物产酶的发酵策略有利于实现低成本、高酶活.

参考文献：

[1] Seguro K, Nio N, Motoki M. Some Characteristics of a Microbial

Protein Cross-linking Enzyme: Transglutaminase [J]. ACS. Symp. Ser., 1996, 650: 271 280.

[2] Ando H, Adadi M, Umeda K, et al. Purification and Characterization

of a Novel Transglutaminase Derived from Microorganism [J]. Agric. Biol. Chem., 1989, 53: 2613 2617.

[3] Motoki M, Kumazawa Y. Recent Research Trends in

Transglutaminase Technology for Food Processing [J]. Food Sci. Technol. Res., 2000, 6(3): 151 160.

[4] Folk J E. Transglutaminase [J]. Ann. Rev. Biochem., 1980, 49:

517 531.

Induced Microbial Transglutaminase Accumulation by Streptomyces hygroscopicus

due to Addition of Hydroxylamine

ZHANG Cheng-jie, DU Guo-cheng, LI Yin, CHEN Jian

(Key Lab. Industrial Biotechnol., Ministry of Education, Lab. Environ. Biotechnol., School of Biotechnology,

Southern Yangtze University, Wuxi, Jiangsu 214036, China)

Abstract: Effect of hydroxylamine addition on the accumulation of microbial transglutaminase (MTG) by Streptomyces hygroscopicus

was investigated. The results showed that the addition of hydroxylamine induced MTG accumulation, and the optimum addition concentration and time of hydroxylamine were 0.5 mmol/L and after 38 h of fermentation, respectively. The maximum MTG activity in the culture broth was 5.3 U/mL and increased by 32.5% compared with the control. After the reaction between hydroxylamine and MTG, L-glutamic acid γ-monohydroxamate was produced, which was proved inhibiting MTG. The induced MTG accumulation was a balance process affected by positive action of hydroxylamine and negative action of L-glutamic acid γ-monohydroxamate. Key words: microbial transglutaminase; Streptomyces hygroscopicus; hydroxylamine; inducer