PCR技术的原理、操作及应用

PCR技术的原理、操作及应用

PCR技术的原理、操作及应用 技术的原理、 技术的原理

湖南省疾病预防控制中心微生物检验科 黄一伟

PCR技术的原理、操作及应用

什么是PCR 什么是

PCR: Polymerase chain reaction,即聚合酶 链反应 是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技 术

PCR技术的原理、操作及应用

PCR技术的发展历史 技术的发展历史

1985 关于PCR 的文章首次由美国科学家 Kary Mullis等人在 《Science》杂志上发表 1989 《Science》杂志报道了耐热性DNA多聚酶 Taq酶 (生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到的一种耐 热的DNA聚合酶 )的发现,预示着分子时代的到来。 12月《Science》杂志将PCR和它所使用的聚合酶命 名为第一个“年度分子”。 1993 Kary Mullis 因PCR的发明获得诺贝尔化学奖。

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PCR技术的原理 1 技术的原理遗传物质： 细胞核 染色体 DNA(脱氧核糖 核酸和磷酸链和碱基构成) 碱基(A、T、C、G)是按双链螺旋 排列的，碱基序列的长度和排列 的顺序决定了生物的多样性。 比如人类体细胞中共有31亿个碱基对， 按上述的0.1%的差，人和人之间 有3百万个碱基对的差别。 PCR的基本工作原理就是以拟扩增的 DNA分子为模板，以一对分别与 模板互补的寡核苷酸片段为引物， 在DNA聚合酶的作用下，按照半 保留复制的机理沿着模板链延伸 直至完成新的DNA合成。

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PCR技术的原理 2 技术的原理PCR反应的基本成分 包括7种基本成分：模板 DNA、特异性引物、热 稳定DNA聚合酶、脱氧 核苷三磷酸(dNTP)、 二价阳离子、缓冲液及 一价阳离子 基本反应步骤 ：变性--退 火--延伸 最后通过染料如EB染色 DNA后在紫外灯下显色 检出

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PCR技术的原理 3 技术的原理

温 度

94 72成 条 单 链 性 变 2 形

22 的

22

2

4

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RT-PCR的原理 的原理相对于PCR,在开始阶段增加步骤：RNA 是单链到双链的过程。 cDNA合成，

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实时荧光定量PCR的原理 1 的原理 实时荧光定量实时荧光定量PCR技术 (RealTime Quantitative PCR) 是指在 PCR反应体系中加入荧光基团 ，利用荧光信号积累实时监测 整个PCR进程，最后通过标准 曲线对未知模板进行定量分析 的方法。常用的荧光定量PCR试剂： SYBR Green I Taqman水解探针

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实时荧光定量PCR的原理 2 的原理 实时荧光定量基线(Baseline) 是指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直 线，这样的直线即基线。 光阈值threshold的设定 一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是 PCR3-15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在PCR扩增的指数期。 CT(Cycle threshold)值 表示每个PCR反应管内荧光信号到 达设定的域值时所经历的循环数。 研究表明，各模板的CT值与该模板 的起始拷贝数的对数存在线性关系， 起始拷贝数越多，CT值越小

,反之 亦然。利用已知起始拷贝数的标准 品可作出标准曲线，其中横坐标代 表起始拷贝数的对数，纵坐标代表 CT值。因此，只要获得未知样品的 CT值，即可从标准曲线上计算出该 样品的起始拷贝数。

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实时荧光定量PCR的原理 3 的原理 实时荧光定量Ct与初始模板的关系固定循环数后，荧光信号与模 板数成正比 初始DNA量越多, 荧光达到阈值 时所需要的循环数(Ct 值)越少 起始模板的对数浓度与Ct呈线 性关系，根据样品的Ct值就可 计算出样品中所含的模板量Δ Rn 3.00 2.50 2.00 1.50 1.00 0.50 0.00 14 16 18 20 22 24 26 28 30 Cycle 32 34 36 38 40

104

103 102 阈值

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PCR技术的优点 技术的优点优点: 特异 敏感 快速、 简便 易自动化等

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PCR技术的局限性 技术的局限性为了构建特定引物，使特定DNA序列的选 择性扩增，必须有一个庞大的已知序列的 数据库。 聚合酶链反应效率差异很大，根据不同的 因素需要优化反应条件。 PCR技术扩增产物的长度有限。

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PCR技术的注意事项 技术的注意事项防止污染，建立良好的质量控制。操作时避免气溶 胶产生，特别注意阳性样品的拿放，使用一次性耗 材，穿戴手套并经常更换，永远在最后一步才加核 酸，液体分装使用等。 引物设计合理 Taq酶扩增错误率较高，大约1/100对碱基/20个循环 镁离子浓度对反应效率的影响 仪器稳定性，升降温速率，管子的密合度等 RT-PCR注意防止RNA降解

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PCR技术的操作 1 技术的操作以流感病毒的RT-PCR和Real-time RT-PCR检测为 例说明PCR技术的操作步骤 主要仪器：PCR仪，Real-time PCR仪，微量移液 器，高速冷冻离心机，电泳仪和电泳槽，凝胶电 泳观察仪或成像系统，生物安全柜等。

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PCR技术的操作 2 技术的操作1. 病毒核酸RNA提取 2. RT-PCR反应或者Real-time RT-PCR反应 3. UV紫外灯检测或者电脑上直接读取结果

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