土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选及其淀粉

酶活力的测定

姓名：李青嵘

班级：生工102

学号：1014200044

同组组员：黄得凤

同组组员：张旭霞

摘要

本实验通过90℃水浴20min预处理，杀死无芽孢菌体，再以弱选择性淀粉培养基和稀释涂布平板法对土壤中产淀粉酶芽孢杆菌进行初步筛选，又通过分区划线法对初筛菌株进一步分离纯化，得到两株纯培养的芽孢杆菌。并通过耐盐试验、明胶试验、糖发酵试验、VP试验、吲哚试验，等多项生理生化实验对筛选出来的菌种进行鉴定，鉴定结果均为蜂房芽孢杆菌。进一步通过3，5-二硝基水杨酸显色法对菌种的淀粉酶活力进行鉴定，测定结果分别为10.68MMU，12.64MMU。

关键词：淀粉酶，芽孢杆菌，酶活测定

1. 前言

淀粉酶是催化淀粉水解的一类酶的总称，广泛存在于动物、植物和微生物中。目前淀粉酶广泛应用多种领域，在发酵工业中淀粉酶可用于淀粉原料的液化及糖化工艺；在食品工业中淀粉酶可用于面包焙烤，使其体积更大，颜色更好，颗粒更柔软；在农业中淀粉酶可作为饲料添加剂，降解饲料中淀粉营养成分以利于动物吸收利用；此外，淀粉酶在医疗卫生、废料处理、纺织印染等领域都有广泛应用。

目前生产应用的淀粉酶主要来源于微生物，并集中在几种细菌和真菌中，尤其以芽孢杆菌所产的淀粉酶较多。其原因首先芽孢杆菌属(Bacillus)中能产生淀粉酶的菌种较多；其次，芽孢杆菌属产的淀粉酶有较好的应用价值，如凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜热芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌产的淀粉酶具有耐热性；再次，芽孢杆菌应用历史悠久，广泛用于饲料添加剂，其安全性有保证。本文主要从土壤中筛选产淀粉酶的芽孢杆菌，分离纯化，并进行酶活测定，从而获得有经济价值比较高的菌株。

2. 材料与方法

2.1. 实验材料

2.1.1. 土样的采集

从广州大学B-8门前采集土样？g，每天加入2 g淀粉和10 ml水进行培养5天。

2.1.2. 培养基

2.1.2.1. 筛选及活化培养基[1]

淀粉20 g，蛋白胨10 g，NaCl 2.5 g，琼脂10 g，自来水1000 ml, pH 自然。

2.1.2.2. 斜面种子培养基[2]

牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂15～20 g，自来水1000 ml，pH 7.2～

7.4；

2.1.2.3. 摇瓶发酵培养基[3]

称取可溶性淀粉2 g，蛋白胨1 g，牛肉膏0．3 g，氯化钠0．5 g溶于100 mL蒸馏水中。pH自然；

2.1.2.4. 蛋白胨液体培养基（作吲哚实验用）[2]

蛋白胨10 g，NaCl 5 g，自来水1000 ml，pH 7.2～7.4，121℃ 灭菌20 min；

2.1.2.5. 葡萄糖蛋白胨培养基（VP和MR试验用）[2]

蛋白胨5 g，葡萄糖5 g，NaCl 5 g，自来水1000 ml，pH 7.2～7.4，121℃ 灭菌20 min；

2.1.2.6. 糖发酵培养基（作细菌糖发酵试验用）[2]

蛋白胨2 g，NaCl 5 g，K2HPO4 0.2 g，1%溴麝香草酚蓝水溶液3 ml，待试糖10 g(一般糖或醇按1 % 量加入，而半乳糖、乳糖按1.5 % 的量加入)，自来水1000 ml，pH 7.2～7.4；

2.1.2.7. 酪氨酸平板（作酪氨酸水解试验用）

L－酪氨酸0.5g悬浮于10mL蒸馏水中，20分钟灭菌，然后于100mL无菌的营养琼脂混合，即成酪氨酸水解平板；

2.1.2.8. 酪素平板（作酪素水解试验用）

取5g脱脂奶粉加入50mL蒸馏水中（或用50mL脱脂牛奶），另称1.5g琼脂溶于50mL蒸馏水中，将两液分开灭菌。待冷至45－50℃时，将两液混匀倒平板，即成牛奶平板；

2.1.2.9. 西蒙斯氏柠檬酸盐培养液（作柠檬酸盐利用试验用）[2]

柠檬酸钠2 g，NaCl 5 g，MgSO4·7H20 0.2 g, K2HPO4·3H20 1 g,(NH4)2HPO4 1 g, 1%溴麝香草酚蓝水溶液10 ml，琼脂15～20 g，自来水1000 ml，pH 7.0 , 121℃ 灭菌20 min；

2.1.2.10. 淀粉牛肉膏蛋白胨琼脂培养基[2]

可溶性淀粉2 g，牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂15～20 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.2～7.4；

2.1.2.11. （2%、5%、7%）高盐培养基[2]

牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl（ 2g、5g、7g），琼脂15～20 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.2～7.4；

2.1.2.12. 明胶培养基

牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，明胶12g，蒸馏水1000 mL ，pH 7.0；

2.1.2.13. 半固体培养基（作运动性实验用）

琼脂含量0.5%，其他组分比例按牛肉膏蛋白胨培养基配制；

2.1.3. 试剂和仪器

2.1.3.1. 碘原液：碘1lg，碘化钾22g，加水定容至50OmL；

2.1.3.2. 单染色：草酸铵结晶紫或石炭酸复红；

2.1.3.3. 革兰氏染色：草酸铵结晶紫染色液，卢戈氏碘液，95%乙醇，0.5%沙黄

染色液。

2.1.3.4. 芽孢染色：5%孔雀绿染色液，0.5%沙黄染色液。

2.1.3.5. V.P试验：40%NaOH 溶液，ɑ-奈酚。

2.1.3.6. 吲哚试验：乙醚，吲哚试剂。

2.1.3.7. 硝酸盐试验：甲液（对氨基苯磺酸0.8g+5mol/L醋酸100mL；乙液（α-

奈胺0.5g + 5mol/醋酸100mL）；

2.1.3.8. 酪素水解：牛奶；

2.1.3.9. 酪氨酸水解：L-酪氨酸；

2.1.3.10. 淀粉酶活力测定：1% 3,5-二硝基水杨酸试剂。

2.1.4. 仪器：

无菌培养皿，接种环，土样，三角瓶，烧杯，试管，酒精灯，无菌吸管，载玻片，吸水纸等。恒温摇床，恒温培养箱，高压蒸汽灭菌箱，超净工作台，水浴箱，磁力搅拌器，涂布器，显微镜，移液管，移液枪。

2.2. 实验方法

2.2.1. 初筛

2.2.1.1. 制菌悬液：

取五份土样各25 g，分别加入装有225mL无菌水和玻璃 …… 此处隐藏：5607字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……