实验总结的几种高效酿酒酵母转化方法

本资料为本研究室实际研究情况并结合文献网络资料总结所得,希望能给同行们带来帮助!欢迎交流!

电转法

设计方案一：

感受态制备：

1. 挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养过夜；

2. 取1mL一级种子分别接种于两瓶50mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm

培养约16-18h(OD:1.3-1.5)；

3. 于4℃离心收集菌体，用25mL冰无菌水洗涤一次后，细胞用10ml冰无菌水重悬，可换成较小的离心管；

4. 加入1ml，pH7.5，10×TE缓冲液，摇晃均匀，再加入1ml 10×LiAc，旋转摇

匀，于30度轻轻摇动45min；

5. 再加入0.4ml 1 mol/L DTT，并同时旋转摇动，于30度轻轻摇动15min；

6. 于4℃离心，弃上清（用枪吸），再用25mL冰无菌水洗涤；

7. 2.5ml冰冷的1mol/L山梨醇洗涤，离心收集菌体，弃上清（用枪吸）；

8. 每管用100ul山梨醇溶解，分装于EP管中（80ul/管），于-70℃冰箱保存。 电转化：

1．向感受态细胞中加入约5～10ug（体积小于10 ul）的DNA，用枪吹吸均匀，

转移至预冷的电转杯中，静置5min；

2．擦干电转杯，电击，电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆；

3．立即加入1ml 预冷的山梨醇，转移至EP管中，于30℃静置1h；

4．离心，弃上清，加入1mL YEPD后，于30℃、200rpm培养2h；

5．离心得菌体后，吸除550 ul上清液，然后按150 ul/板进行涂板。

说明：该方法可直接采用50或100mL体系的一步法，即直接挑单菌落于YEPD中培养至预定菌浓，也可采用试管摇菌收集菌体制备感受态。

设计方案二：

感受态制备：

1. 挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养过夜；

2. 取1mL一级种子分别接种于两瓶50mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm

培养约16-18h(OD:1.3-1.5)；

3. 于4℃，5000rpm，5min离心收集菌体，用25mL冰无菌水洗涤后，细胞重悬

于8ml处理液中（处理液配方：100 mM LiAc， 10 mM DTT， 0.6 M山梨醇，10 mM Tris-HCl，pH 7.5），室温静置30min；

4. 4℃，5000rpm，5min离心收集菌体，用1.5mL 1mol/L预冷的山梨醇洗涤三

次，离心条件一样；

5. 每管用100ul山梨醇溶解（以黄枪头能吸取为宜，菌浓低时可适量少加入山

梨醇），最后以80 ul的终体积转移至EP管中（菌体太多可适当放弃部分），置于-70℃冰箱保存。

电转化：

1. 向感受态细胞中加入约3ug（体积小于10ul）的DNA，用枪吹吸均匀，转移

至预冷的电转杯中，静置5min；

2. 擦干电转杯，电击，电击参数：2.0KV，25uF，200欧姆；

3. 立即加入1ml 预冷的山梨醇，转移至EP管中，于30℃静置1h；

本资料为本研究室实际研究情况并结合文献网络资料总结所得,希望能给同行们带来帮助!欢迎交流!

4. 离心，弃上清，加入1mL YEPD后，于30℃、200rpm培养2h；

5. 离心得菌体后，吸除550 ul上清液，然后按150 ul/板进行涂板。

说明：处理液中的DTT是在使用前加入，其它配好后于4度保存，DTT单独于-20度保存，可配成100倍的贮备液。制备体系可按比例放大。

设计方案二特别适合于采用一步法制备感受态细胞

具体如下：

1. 挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中或转接于50mL YEPD中，在30℃、

250-300rpm 条件下培养至OD=6-10（为防止菌体老化，可将50mL培养体系提早收获细胞，取菌体时，以1mL/次，取菌两次或三次不等，使用菌浓达到预定的OD:6-10）；

2. 取1mL菌液分装于EP管中，于4℃，12000rpm离心30s，弃上清；

3. 收集菌体，用预冰的无菌水洗涤两次，离心条件一样；

4. 所得菌体用1mL处理液（配方同上）于室温下处理30min；

5. 离心，弃上清，加入1ml 1M 预冷山梨醇，离心，弃上清，重复两次；

6. 最终用1M 预冷山梨醇溶解菌体至终体积为80 ul，于-70℃冰箱保存；

7. 电转方法同上。

8. 每一步的离心均30s即可，在较短的时间内制备出的感受态转化效率特别高。

备注：OD检测均为600nm，空白参比为：YEPD，高浓测定时应稀释测定。所有无菌水与山梨醇均在冰上预冷处理；在制备感受态阶段，所有离心均在4℃条件下。

醋酸锂转化法

方案一：

1. 挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中，30℃、200rpm培养过夜；

2. 取1mL一级种子分别接种于两瓶50mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm

培养约5h(OD:0.5-0.8)；

3. 于4℃，5000rpm，5min离心收集菌体；

4. 25mL冰无菌水洗涤两次，离心条件一样；

5. 用1mL 0.1M LiAc悬浮，离心收集菌体；

6. 再用0.5mL 0.1M LiAc悬浮，以50 ul/管分装于EP管中，置于冰上备用；

7. 依次向上述50 ul感受态细胞中加入50% PEG3350 ：240ul、1M LiCl：36ul、

2mg/ml 单链DNA：50ul、转化DNA（5-10ug）：50ul；

8. 剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）；

9. 30℃水浴孵育30min；

10.42℃水浴热休克20～25min；

11.13000rpm离心30s收集酵母菌体，重悬酵母于1ml YEPD培养基，30℃摇床

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孵育4h；

12.离心收集沉淀菌体，取除约800 ul上清液，然后按每100 ul/板进行涨涂板。 方案二：

1、接种液体YEPD培养基，过夜培养至1-2×107cells/ml；

2、取1mL一级种子分别接种于两 …… 此处隐藏：1327字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……