分光光度法测定胆固醇含量

大学有机化学实验报告

实验八、分光光度法测定胆固醇含量

一、实验目的

1、学习721分光光度计的使用

2、掌握分光光度法测定胆固醇含量的原理

3、学习并掌握利用分光光度法制作胆固醇含量标准曲线的方法

二、实验原理

当一束平行的单色光照射到有色溶液时，光的一部分被溶液吸收，一部分透过溶液。假设入射光强度为I0，透过光强度为It，溶液的浓度为C，液层宽度为b，则

T＝－I0

A log

It

（透光度或透光率）

I0

K C b （朗伯－比尔定律的数学表达式） It

式中：A为吸光度，没有单位

K随C、b的单位而不同

C：g/L, b : cm , k: L/g·cm ,为吸光系数；

C：mol/L, b : cm , k: L/mol·cm ,为摩尔吸

光系数

以上式子表明：当一束单色光通过有色溶液时，其吸光度与溶液浓度及宽度成正比。当k、b都一定时，A与C成正比，因此若已知浓度溶液（即试样溶液）的吸光值As，在相同条件下测出未知浓度溶液的吸光值Ax，则试样溶液的浓度Cx可通过下式求出：

AsCsA Cx x Cs（标准对照法，适用于非经常性的分析工作） AxCxAs

若是经常性的批量测定，则应用标准曲线法，即配制一系列已知浓度的标准溶液，在选定波长处，用同样的比色皿分别测其吸光值。作出“吸光值/含量”的标准曲线，在相同条件下测定未知浓度试样的吸光值，直接可从标准曲线上查出相应的浓度。

三、实验药品及仪器

药品: FeCl3·6H2O ，磷酸(A.R. 即“分析醇”) ， 浓硫酸（A.R.）， 胆固醇（C.P.），

无水乙醇。

试剂：10％三氯化铁溶液：10g FeCl3·6H2O溶于磷酸，定容至100ml，存棕色瓶中，冷藏

磷硫铁试剂（P-S-Fe试剂）：取1.5ml 10％三氯化铁溶液于100ml棕色容量瓶加

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浓硫酸至刻度。

胆固醇标准溶液（0.08mg/ml）：称取80mg胆固醇溶于无水乙醇定容至100ml，配制成 10×的标准贮存液。

10×贮存液用无水乙醇稀释10倍，即为胆固醇标准溶液。

仪器：721分光光度计 ， 比色皿 ， 试管 ， 移液管

四、仪器使用（721分光光度计）

1.接通仪器电源开关，打开比色皿暗箱盖，选择所需的单色光波长,预热20分钟；

2.将盛溶液的比色皿装入暗盒中（一般装空白溶液的比色皿放在第一格，装待测溶液的比色皿放在后面）

3.打开比色皿暗箱盖（光门自动关闭），调节“0”电位器，使电表指针指“0”（透光率为0），然后将盖子盖上（光电管受光），这时空白溶液的比色皿须正对于光路上，调节“100％”电位器，使电表指针指在“100”（透光率100%），若调不到100，可提高灵敏度。

4.连续几次调“0”和“100”后，就可以进行测定。测定时，将比色皿拉杆轻轻拉出一格，使第二个比色皿内的待测溶液进入光路，此时指针所指的读数就是该溶液的吸光度。重复上述测定操作1-2次，读取相应的吸光度值，取平均值。 5．实验完毕，切断电源，将比色皿取出洗净。 注意事项：

1.读数时，视线要正对着指针，表上两排数据不要读错，小数点也不要读错！ 2.放大器灵敏度有五档，“1”最低。其选择原则是保证能使空白档良好调到“100”情况 下，尽可能采用低灵敏度，这样仪器将有更高的稳定性。所以使用时一般置“1”，灵敏 度不够时再逐渐升高，但改变灵敏度后须重新调“0”和“100”。

3.拿比色皿时用手捏住毛玻璃两面，切不可触摸光面。每次使用完毕，应洗净，滤纸吸干， 不可用碱液和强氧化剂洗比色皿，避免腐蚀玻璃或使皿粘结处脱胶。 4.比色皿放入比色皿架前，须用擦镜纸吸干外壁的水珠。

五、实验内容

1、配制10％三氯化铁溶液、磷硫铁试剂、胆固醇标准溶液 2、打开721分光光度计预热20分钟

3、取6根试管，编号1-6， 各管分别加入0.08mg/ml胆固醇标准液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml，以无水乙醇补足至2.0ml，然后1-6管均各加入2.0ml磷硫铁试剂，摇匀。10分钟后分别转移到0.5cm光径的比色皿内，用721分光光度计在560nm波长的单色光下，先用1号管的空白对照调“0”和“100”，然后同等条件下分别测定2-6管的吸光值 A，记录数值。

4、算出各管胆固醇的实际浓度（单位：mg/ml）,然后以胆固醇浓度为横坐标，相应的吸光值为纵坐标，作标准曲线。

备注:各管胆固醇实际浓度C的计算公式

C实际=胆固醇标准液原浓度×移取的胆固醇标液体积V÷各管总体积

=0.08 × V（胆固醇体积）÷4 (单位为:mg/ml )

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六、实验数据记录

用坐标纸画出标准曲线

（1）胆固醇的生理功能：

参与血浆蛋白的组成；细胞膜的结构成分；胆汁酸盐、肾上腺皮质激素和维生素D等的前体。

（2）临床意义：血清中总胆固醇的浓度可作为脂类代谢的指标，但脂类代谢又常与糖类及激素的代谢密切相关，故在其他物质代谢异常时亦可影响血清总胆固醇的浓度。

胆固醇是环戊烷多氢菲的衍生物，主要来自体内合成，一部分直接从食物中摄取。胆固醇在体内不仅参与血浆脂蛋白的合成，而且可转变为胆汁酸盐、维生素D3及某些类固醇激素(性激素、肾上皮质激 …… 此处隐藏：1527字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……