第7章 蛋白质的分离、纯化和表征

第7章 蛋白质的分离、纯化 和表征Protein Separation, Purification and Characterization

Protein Purification and Characterization

因材施法，有的放矢

Protein Purification and Characterization对蛋白质分子进行的各种研究，要建立在对蛋白 质分子本身的性质(特别是区别于其它生物与 化学分子的独特的性质)和各种实验手段的原 理和适用性深入了解的基础上。透析 袋内

蛋白 质大分 半透 子

小分 子

膜

透析 袋外

小分 子

Protein Purification and Characterization 分离和纯化蛋白质的各种方法主要是利

用蛋白质之间各种特性的差异，包括： 分子的大小和形状 酸碱性质

溶解度 吸附性质

对配体分子的特异生物学亲和力

Protein Purification and Characterization The aim of protein purification is to isolate

one particular protein from all the others in the starting material, exploits利用: Solubility Size Charge Hydrophobicity or/and specific binding affinity of the protein of interest

7.1 蛋白质的酸碱性质 Ionization of protein 对某一种蛋白质来说，在某一pH,它所带的正

电荷和负电荷恰好相等，也即净电荷为零，这 一pH称为蛋白质的等电点 (isoelectric point, pI)。

沉淀技术++ + + + ++ +带正电荷蛋白质 (亲水胶体)

碱 酸等点电时的蛋白 质(亲水胶体)

碱 酸

-- - - - -- -带负电荷蛋白质 (亲水胶体)

带正电荷蛋白质 (疏水胶体)

脱 水 ++ + + + ++ +

脱 水

碱不稳定蛋白颗粒 (沉淀)

酸

脱 水 - - - - - - - -

带负电荷蛋白 质(疏水胶体)

蛋白质胶体颗粒沉淀

Ionization of protein 蛋白质的滴定曲线形状和等电点，在有中性盐存在下

可以发生明显的变化。 蛋白质等电点在一定程度上决定于介质中离子的组成。 没有其他盐类干扰时，蛋白质质子供体基团解

离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数 相等时的pH称为等离子点(isoionic point)。

Ionization of protein+Overall charge on protein acid excess positive charge Cation exchanger isoelectric point balanced positive and negative charge

alkaline excess negative charge Anion exchanger

3

10

pH

The overall charge on a protein depends on pH _

7.2 蛋白质分子的大小与形状 Protein size and shape 7.2.1 根据化学组成测定最低相对分子质量铁的原子量 铁的百分含量=─────── ×100 最低相对分子质量 铁的原子量 最低相对分子质量=───────×100 铁的百分含量

Protein size and shape55.8

例如，肌红蛋白相对分子质量=───×100 0.335

=16700 用其他物理化学法法测得的 肌红蛋白Mr与此极为接近，可 见肌红蛋白分子中只含一个 铁原子。

7.2.2 渗透压法

测定相对分子质量 渗透与渗透压

渗透压法测定相对分子质量 溶剂分子由纯溶剂(或稀溶液)向溶液(或浓

溶液)单方向净移动现象称为渗透(osmosis)。 渗透的结果，溶液内的体积增加，液面升高， 直至达到一定的静水压力时维持平衡。这时的 静水压力就是溶液在平衡浓度时的渗透压 (osmotic pressure)。 渗透压是单位体积内溶质质点数的函数，而与 溶质的性质和形状无关。

渗透压法测定相对分子质量 在浓度不大时，渗透压与溶质的相对分子量的

关系为： π= RT(c/Mr

+ K c2 )

Mr = RT/ limπ/c

c→0

7.2.3 蛋白质的扩散和扩散系数 扩散(diffusion) dm/dt =-DA dc/dx

D 扩散系数， A 扩散面积 扩散系数随Mr的增加而降低。 但扩散系数对Mr的变化并不敏感，一般不单独

用来确定Mr。

7.2.4 沉降分析法测定相对分子质量 蛋白质溶液在电场中受到强大的离心力作用时，如果

蛋白质的密度大于溶液的密度，蛋白质分子就会沉降。 沉降的速率与蛋白质分子大小和密度有关，而且与分 子形状、溶液的密度和粘度有关。 沉降速率法 沉降平衡法