浙江大学课件(PCR扩增及相关技术)

浙江大学分子生物学课件

PCR扩增及相关技术 PCR扩增及相关技术基因组DNA提取、电泳分析与酶切

浙江大学生物技术研究所陈卫良

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I. PCR技术概论 PCR技术概论

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一、 PCR技术的基本原理) PCR(Polymerase Chain Reaction Reaction,聚合酶链反应)是 DNA RNA的方法。它包括3个基本 3一种选择性体外扩增DNA RNA DNA或RNA (1). (denature): DNA 94℃下解链；步骤：(1).变性(denature): (denature):目的双链DNA 94 DNA在94 (anneal) (50 (2).退火(anneal) (anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50 (50℃左 ) (3).右)下与模板上的目的序列通过氢键配对；(3).延伸 extension) TaqDNA DNA (extension) extension):在TaqDNA TaqDNA聚合酶合成DNA DNA的最适温度 DNA 3下，以目的DNA DNA为模板进行合成。由这3个基本步骤组成 DNA一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA DNA扩增一倍， DNA,这些经合成产生的DNA DNA又可作为下一轮循环的模板,所以 25-35 DNA 10经25-35 25-35轮循环就可使DNA DNA扩增达106倍。

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PCR原理图

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附: PCR扩增的长产物片段和短产物片段PCR: PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分:在第一 DNA 3个反应周期中，以两条互补的DNA DNA为模板，引物是从3’端开始延 5 3伸，其5‘端是固定的，3’端则没有固定的止点，长短不一，这就“”是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外， (“”还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合时， 5 3由于新链模板的5‘端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3’端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增“”序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。这是需要扩增的特定片段。”“”由上可见“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段” PCR则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR PCR的反应产物 DNA不需要再纯化，就能保证足够纯DNA DNA片段供分析与检测用。

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二、标准的PCR反应体系10 10×扩增缓冲液 10ul 10× 4 dNTP 200umol/L 4种dNTP dNTP混合物各200umol/L 10 100pmol 引物 各10 100pmol 10~100pmol DNA 0.1 2ug 模板DNA 0.1 2ug 0.1~2ug Taq DNA DNA聚合酶 2.5u 2.5u Mg Mg2+ 1.5mmol/L 100ul 加双或三蒸水至 100ul PCR ( PCR PCR反应五要素(参加PCR PCR反应的五种主要物 ) dNTP质):引物、模板、酶、dNTPs和 Mg2+ dNTPs

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1、引物设计原则PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。 PCR PCR .引物的好坏往往是PCR PCR成败的关键.引物设计和选 DNA择目的DNA DNA序列区域应遵循下列原则： 20bp①、引物长度： 15-30bp 15-30bp,常用为20bp 20bp左右。太短会

降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高；太长则比较浪费，且难以合成。 1kb②、引物扩增跨度：1kb 1kb之内是理想的扩增跨度， 3kb 2kb左右是有效的扩增跨度，而超过3kb就无法 2kb . 10kb得到有效的扩增.特定条件下可扩增长至10kb 10kb的片段。

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1、引物设计原则G+C 40-60% G+C③、引物碱基：G+C G+C含量以40-60% 40-60%为宜，G+C G+C太少扩增效果不佳，G+C G+C过多易出现非特异条 ATGC 5带。ATGC ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④、避免引物内部出现二级结构，避免两条引物 3间互补，特别是3‘端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 3⑤、引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不 PCR配对而导致PCR PCR失败。

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1、引物设计原则⑥、引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。引物5'端对扩增特异性影响不大，可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等。通常应在5'端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。⑦、引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。

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1、引物设计原则⑧、所扩增产物本身无稳定的二级结构，以免产生非

特异性扩增，影响产量。⑨、引物量：每条引物的浓度0.1~1umol或10-100pmol, 10-1以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 Primer常用的引物设计软件： Oligo 6;Primer Premier; Vector NTI Suit Suit; Dnasis Omiga Dnasis; Omiga; Dnastar

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2、模板与酶DNA RNA模板可以是DNA DNA,也可以是RNA RNA;可以是线状或 10环状。一般反应中模板数量为102-105个拷贝。对 0.1 DNA单拷贝基因来说，需要0.1 g的人基因组DNA DNA, 10ng的酵母DNA 1 ng的大肠杆菌DNA DNA DNA DNA, DNA。扩增多拷贝基因时，用量更少。 TaqDNA: TaqDNA TaqDNA聚合酶:一般TaqDNA TaqDNA聚合酶活性半衰期 92 .5℃,为92 .5, 130min; 95, 40min; 97, 5 min. 95℃, 97℃, TaqDNA 2X10 TaqDNA聚合酶的出错率为2X10-4/每轮循环。在 TaqDNA 100 lPCR反应中， 1.5-2.5 100 lPCR 1.5-2.5单位的TaqDNA TaqDNA聚合酶 30就足以进行30 30轮循 …… 此处隐藏：2405字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……