第五课蛋白质和多肽的氨基酸序列测定

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第五课蛋白质和多肽的氨基 酸序列测定

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蛋白质和多肽是由20种氨基酸按照一定的顺序通过肽键连接成一长 蛋白质和多肽是由 种氨基酸按照一定的顺序通过肽键连接成一长 然后通过链内、链间的离子键、疏水作用等多种作用力进行折叠、 链，然后通过链内、链间的离子键、疏水作用等多种作用力进行折叠、 卷曲形成一定的构象并发挥其独特作用。 卷曲形成一定的构象并发挥其独特作用。氨基酸的排列顺序即蛋白质的 一级结构决定了蛋白质的高级结构及功能。因此， 一级结构决定了蛋白质的高级结构及功能。因此，测定蛋白质的氨基酸 序列是进行蛋白质结构功能研究中不可缺少的部分。另外， 序列是进行蛋白质结构功能研究中不可缺少的部分。另外，蛋白质一级 结构的信息也有助于对其基因结构的研究。 结构的信息也有助于对其基因结构的研究。 目前，进行蛋白质序列测定有两个关键步骤， 目前，进行蛋白质序列测定有两个关键步骤，即： 氨基酸残基一个一个依次从蛋白质和多肽的末端切割下来； ①氨基酸残基一个一个依次从蛋白质和多肽的末端切割下来； 正确鉴定每次切割下来的氨基酸残基。 ②正确鉴定每次切割下来的氨基酸残基。 其中第一步可采用化学法或酶法进行裂解。 其中第一步可采用化学法或酶法进行裂解。由于化学法较之酶法具有 裂解率高、易于自动化、耗费少等诸多优点， 裂解率高、易于自动化、耗费少等诸多优点，被蛋白质化学实验室普遍 采用，可以从蛋白质和多肽的N端进行裂解 也可以从C端进行分析 端进行裂解， 端进行分析。 采用，可以从蛋白质和多肽的 端进行裂解，也可以从 端进行分析。 第二步通常是在氨基酸残基上衍生了一个生色基团， 第二步通常是在氨基酸残基上衍生了一个生色基团，通过高效液相色 谱进行分离分析。 本章将就蛋白质和多肽的N端 谱进行分离分析。 本章将就蛋白质和多肽的 端、C端氨基酸序列分析 端氨基酸序列分析 的原理和方法、进行序列分析前蛋白质和多肽样品的准备作一介绍。 的原理和方法、进行序列分析前蛋白质和多肽样品的准备作一介绍。

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第一节 N端分析原理 端分析原理一、耦 联 蛋白质和多肽的自由α—氨基经与异硫氰酸苯酯 氨基经与异硫氰酸苯酯(PITC)试 蛋白质和多肽的自由 氨基经与异硫氰酸苯酯 试 剂耦联后，与其紧邻的第二个残基的键合力大大减弱， 剂耦联后，与其紧邻的第二个残基的键合力大大减弱，很容 易断裂。 易断裂。

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二、裂 解 在无水条件下酸裂解，仅仅切下反应的那个残基。 在无水条件下酸裂解，仅仅切下反应的那个残基。紧

挨的 第二个氨基酸残基暴露出自由的α—氨基，又可与 氨基， 第二个氨基酸残基暴露出自由的 氨基 又可与PITC进行 进行 耦联反应。 耦联反应。

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三、转 化 ATZ—氨基酸不稳定，在三氟乙酸水溶液 %)中可转化 氨基酸不稳定， 氨基酸不稳定 在三氟乙酸水溶液(25% 中可转化 成稳定的PTH—氨基酸。 氨基酸。 成稳定的 氨基酸

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四、PTH—氨基酸的鉴定 PTH— 可以通过薄层层析、气相色谱、 可以通过薄层层析、气相色谱、高效液相色谱及 质谱等各种手段进行分析。 质谱等各种手段进行分析。近年来由于高效液相色 谱技术具有分析速度快、灵敏度高、 谱技术具有分析速度快、灵敏度高、定性定量准确 等诸多优点，并且仪器自身结构也日臻完善， 等诸多优点，并且仪器自身结构也日臻完善，被广 泛应用于PTH—氨基酸的鉴定。通常选用C 18反 泛应用于PTH—氨基酸的鉴定。通常选用C—18反 相柱进行分离。 相柱进行分离。

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第二节 N端蛋白质序列仪 端蛋白质序列仪三、气相序列仪 自动化蛋白质序列仪刚问世时，需要样品量为1~ 自动化蛋白质序列仪刚问世时，需要样品量为 ~2mg。1978年Tarr 。 年 等将一种四级铵盐聚合物“ 引入了蛋白质、 等将一种四级铵盐聚合物“polybrene”引入了蛋白质、多肽的序列测 引入了蛋白质 它能和肽链中的极性基团作用(非共价键合 非共价键合)而将蛋白质和多肽有效 定，它能和肽链中的极性基团作用 非共价键合 而将蛋白质和多肽有效 地固定在玻璃纤维支持膜上，防止了萃取时样品的损失。 地固定在玻璃纤维支持膜上，防止了萃取时样品的损失。为了适应分子 生物学对蛋白质微量分析的要求， 世纪 年代初， 世纪80年代初 生物学对蛋白质微量分析的要求，20世纪 年代初，Hewick及 及 Hunkpillar等人改进了自动化蛋白质序列仪中的仪器结构，它用弹筒型 等人改进了自动化蛋白质序列仪中的仪器结构， 等人改进了自动化蛋白质序列仪中的仪器结构 玻璃反应室(内部体积约 内部体积约0.05m1)代替了液相序列仪中的旋转玻璃杯，用 代替了液相序列仪中的旋转玻璃杯， 玻璃反应室 …… 此处隐藏：4282字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……