实验一 底物浓度对酶活性的的影(带图片)3

实验一 底物浓度对酶活性的影响 ——碱性磷酸酶米氏常数的测定

一、实验原理

⒈ 在温度、PH和酶浓度一定时，底物浓度对酶活性（V）的影响，可用米氏方程表示为：

V=

Vmax[S]

Km [S]

三、操作

⒈ 酶反应进程曲线的制作。该曲线有助于找到合适的酶反应时间以测定初速度，以及估计出合适的酶量与底物浓度，为米氏常数测定作准备。

A．取五支试管，编号，依次加入0.4mL底物溶液，0.9mL碳酸缓冲液，0.6mL蒸馏水。另取同样数量的试管，编号，作为空白对照管，用蒸馏水代替底物溶液。

B．充分混匀，置37℃水浴中，保温5分钟。

C．在各管中加入碱性磷酸酶溶液0.1mL，立即混匀，在37℃水浴中，式中Vmax为最大反应速度，Km表示米氏常数，[S]表示底物浓度，当 V=

12

Vmax时，Km＝[S]。

Km是酶的特征性常数，测定酶的Km值是研究酶性质的重要方法之一。大多数酶的Km值在0.01－100mM之间。对于不同的底物，酶有不同的Km值。

本实验以碱性磷酸酶为例，测定在不同底物浓度时酶活性的变化。然后再分别以

1

[S]

为横座标，以

1V 为纵座标作图，从图上可以方便地求出

碱性磷酸酶的Km值。

⒉ 在本实验中，利用分光光度比色法测定酶的活性。碱性磷酸酶可作用于多种底物。当它作用于磷酸苯二钠时，释放出酚。酚在碱性溶液中与4－氨基安替比林作用，并经铁氰化钾氰化生成红色的醌类化合物，该化合物在510nm处有显著光吸收。与标准酚的溶液作对照或制作标准曲线，可计算出在不同底物浓度时酶的活性。 显色反应的原理如下：

二、试剂：

⒈ 酚贮存标准液：溶解（AR）酚1g于0.1mol/L盐酸中，用0.1mol/L盐酸稀释至1L。此酚溶液含量约为1mg/mL。须进行标定。标定方法见上海市医学化验所主编《临床生化检验》上册第十章，酚类测定。

⒉ 酚应用标准液（0.1mg/mL）：使用前将酚贮存标准液用蒸馏水稀释10倍。此液只能保存2～3天。

⒊ 0.1mol/L碳酸缓冲液（pH=10）：溶解3.18g无水碳酸钠和1.68g碳酸氢钠于500mL蒸馏水中。

⒋ 0.5mol/L NaOH 500mL。溶解10g NaOH于500mL蒸馏水中。 ⒌ 0.01mol/L Tris-醋酸缓冲液（PH=8.8）：配制0.1M Tris溶液100mL，另配制0.1M的醋酸镁溶液100mL。将二种溶液混合，加蒸馏水至900mL。用1％醋酸调节pH至8.8，再用蒸馏水加至1L。

⒍ 0.5％铁氰化钾溶液：分别溶解5g铁氰化钾和15g硼酸于二份400mL蒸馏水中，将二种溶液混合，加蒸馏水至1L，棕色瓶保存。

⒎ 0.3％ 4－氨基安替比林溶液：溶解3g 4－氨基安替比林和42g硫酸氢钠于1000mL蒸馏水中。置棕色瓶中冰箱保存。

⒏ 0.04mol/L底物溶液：溶解10.16g的磷酸苯二钠（含二个结晶水）于1000mL煮沸冷却的蒸馏水中，加氯仿数滴，贮于棕色瓶中，冰箱保存，可用一周。

⒐ 5mg/100mL碱性磷酸酶溶液：溶解5mg碱性磷酸酶（Sigma,No.3877）于100mL pH=8.8 Tris-醋酸缓冲液中，冰箱保存。

分别准确反应5，10，15，20，25分钟。

D．反应用1.0mL 0.5mol/L的NaOH终止，接着依次加入1.0mL 4－氨基安替比林，2.0mL铁氰化钾溶液，充分混匀，10分钟后，测定OD510或A510。

E．分别以OD510为纵座标和反应时间为横座标，画出酶反应进程曲线。 ⒉米氏常数的测定

取8支试管，编号，按下表操作，注意准确吸取酶和底物的量。

管的OD510，记录结果。 四、结果：

⒈ 计算出各管的底物浓度[S]，用mM表示。 ⒉ 利用公式：

OD标准管COD未知管＝标准管

C未知管

C为浓度，计算出各管的酶活性U，用酶活力单位数表示。本实验中，定义在37℃下，10分钟产生1mg酚为一个酶活力单位。

⒊ 将米氏方程式转化为Lineweaver-Burk方程式，得1V

=

Km111

1Vmax ·[S]＋Vmax。以[S]为横座标，以V为纵座标作图。

KmVmax为直线斜率。纵坐标的截距为1

Vmax ，直线与横座标相交于

1

Km

，以求得Km值。 实验二 蛋白质浓度测定――双缩脲法

目的要求

学习双缩脲法测定蛋白质的原理和方法。 原理

具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，因此蛋白质在碱

性溶液中，能与Cu2形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，故可用来测定蛋白质的浓度。 试剂和器材 一、测试样品 ⒈ 标准蛋白溶液

10mg/mL牛血清白蛋白溶液或相同浓度的酪蛋白溶液（用0.05M氢氧化钠溶液配制）。作为标准用的蛋白质要预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度称量、配制成标准溶液。 ⒉ 测试样品液

人（鸭）血清（稀释10倍）。测定其它蛋白样品应稀释适当倍数，使其＋

一、原理

层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差别（如吸附力，溶解度，分子形状、大小和极性等），使各组分以不同的程度分布在两相中。其中固定不动的称固定相，流过此固定相的液体或气体称流动相。从而使各组分以不同的速度随流动相向前移动而达到分离的目的。

20世纪初发现植物中各种颜色的色素可以在吸附柱上流动后排列成色谱，从而可以分离提取植物色素，故称为色谱分离法。后来无色物质也可利用吸附柱分离。1944年开始用滤纸作为固定相出现了纸层析后，层析法不断发展，成为生物 …… 此处隐藏：11352字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……