郑州大学硕士学位论文

磁微粒甲胎蛋白（AFP）化学发光免疫检测系统的研究及临床应

用

姓名：张泉申请学位级别：硕士专业：医学免疫学指导教师：杜英；秦东春

201105

摘要

磁微粒甲胎蛋白（ＡＦＰ）化学发光免疫检测系统

的研究及临床应用

硕士学位申请人：张泉推荐导师：杜英教授

秦东春‘教授

郑州大学基础医学院微生物免疫学教研室

河南郑州４５０００１

摘要

甲胎蛋白（ＡＦＰ）是迄今为止发现的原发性肝癌最灵敏、最特异的肿瘤标志物，７０—９５％的原发性肝癌患者呈现ＡＦＰ水平升高，血液中甲胎蛋白水平对于肿瘤的早期发现，病情的发展、治疗后的评价、监测复发和转移等方面都具有一定的应用价值。本论文主要进行磁微粒甲胎蛋白（ＡＦＰ）化学发光免疫检测系统的研究与临床研究，在磁微粒包被技术平台和化学发光技术平台上，结合双抗体夹心法的免疫学反应技术优势，开发出诊断试剂盒，用于人血清中甲胎蛋白的检测。

研究方法与结果：

１．甲胎蛋白定量检测试剂盒的研发：主要包括生物活性原材料的筛选，磁微粒的包被、酶结合物和校准品生产工艺研究、试剂盒反应体系研究、正常参考值的确定以及稳定性研究。

（１）磁微粒包被工艺：本试剂盒固相载体选用羧基磁微粒，包被方法确定为羧基两步；

（２）试剂盒反应体系：采用两步法反应模式，第一步：

２５９ｌ样本＋２０９ｌ

磁微粒＋５０Ｉ．ｔｌ样品稀释液，３７。Ｃ温育１５ｍｉｎ，洗涤６次；第二步：加入１００９ｌ酶

摘要

结合物，

３７。Ｃ温育１５ｍｉｎ，洗涤６次；分别加入底物Ａ、底物Ｂ各５０１．ｔｌ震荡混

匀后，避光５—１０ｍｉｎ内测定。

（３）参考值的确定：检测６１５例正常人样本，通过百分位数法确定参考值

为１０．０ｎｇ／ｍｌ。

（４）稳定性研究：对产品进行了加速稳定性和实时稳定性研究。分别于３７℃加速破坏条件下放置１０天和实际储存条件２＂－－－－８℃放置１４个月后对试剂盒进行检测，产品的各项性能指标仍能够满足产品标准的要求。将产品的效期定为２～８℃储存１２个月是安全合理的。２．甲胎蛋白定量检测试剂盒性能评价

（１）准确性：用参考物质作为样本进行检测，试剂盒准确性均值在０．９００－－－－１．１００范围内。

（２）最低检测限：最低检出限不大于１．８ｎ∥ｍｌ。

（３）剂量一反应曲线线性：在１．８～１０００ｎｇ／ｍｌ线性范围内，试剂盒的相关系数ｒ应三０．９９００

（４）精密性：用不同浓度的样本各重复检测１０次，其变异系数（ｃｖ）应不大于１０％

．（５）批间差：批问变异系数（ＣＶ）应不大于１５．０％

（６）特异性：人血清白蛋Ｉ刍（５００ｎｇ／ｍ１）、ＨＣＧ（１０００ＩＵ／ｍ１）、ＰＲＬ（５００ｎｇ／ｍ１）均无交叉反应性。

，

（７）干扰物质：５０ｍｇ／ｄｌ胆红素、８１ｍｇ／ｄｌ血红蛋白、３０００ｍｇ／ｄｌ脂质对本

试剂盒无干扰作用。

３．甲胎蛋白定量检测试剂盒（磁微粒化学发光法）的临床研究：

以已上市同品种试剂盒为对照，通过对原发性肝癌术前及术后监测、肝部良性疾病和其他肿瘤患者血清合计１１７３例临床检验样本进行对比检测，结果显示，本试剂盒与对照试剂盒相比，阴性符合率为９７．８５％，阳性符合率为９８．３２％，总符合率为９８．０４％，相关系数为Ｏ．９９７１。可以用于临床ＡＦＰ含量的检测。

结论：

本研究选择高特异性和高灵敏度的单克隆抗体包被，建立开发出磁微粒化学发光法检测ＡＦＰ系统，灵敏度、特异性、稳定性等各项主要指标可以达到国内领先水平，跻身国际先进水平行列，且操作简便快速，易实现自动化操作，能够更好地满足国内临床使用需求。

ＩＩ

摘要

关键词：甲胎蛋白；磁微粒；化学发光；单克隆抗体；生产工艺研究；临床研

究

Ａｂｓｔｒａｃｔ

ＭａｇｎｅｔｉｃｐａｒｔｉｃｌｅｓＡＦＰ（ＡＦＰ）ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ

ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｓｙｓｔｅｍ

ＰｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅＺｈａｎｇＯｕａｎ

ＴｕｔｏｒＰｒｏｆｅｓｓｏｒＤｕＹｉｎｇ

ＰｒｏｆｅｓｓｏｒＤｏｎｇｃｈｕｎＱｉｎ

ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＢａｓｉｃＭｅｄｉｃａｌ

Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＺｈｅｎｇｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ

Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ４５０００１

Ａｂｓｔｒａｃｔ

Ａｌｐｈａ—ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＦＰ）ｆｏｕｎｄ

ｉｎ

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ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ

ａｎｄ

ｍｏｓｔｓｐｅｃｉｆｉｃｔｕｍｏｒｍａｒｋｅｒ，７０－９５％ｏｆｐｒｉｍａｒｙｌｉｖｅｒｃａｎｃｅｒ

ｐａｔｉｅｎｔｓ

ｓｈｏｗｅｄｅｌｅｖａｔｅｄ１ｅｖｅｌｓｏｆＡＦＰ．ＡＦＰｌｅｖｅｌｓｉｎｔｈｅｂｌｏｏｄｆｏｒｅａｒｌｙｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｃａｎｃｅｒ，

ｔｈｅｄｉｓｅａｓｅｐｒｏｇｒｅｓｓｅｓ，ｔｒｅａｔｍｅｎｔｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇｏｆｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅａｎｄ

ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，

ｅｔｃ．ｈａｖｅ

ａ

ｃｅｒｔａｉｎｖａｌｕｅ．Ｉｎｔｈｉｓｔｈｅｓｉｓ，ｔｈｅｍａｇｎｅｔｉｃｐａｒｔｉｃｌｅｓａｌｐｈａ—ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＦＰ）

ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓｙｓｔｅｍｒｅｓｅａｒｃｈ

ａｎｄ

ｃｌｉｎｉｃａｌｓｔｕｄｉｅｓ，ｔｈｅｍａｇｎｅｔｉｃ

ｐａｒｔｉｃｌｅｓｃｏａｔｅｄｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｐｌａｔｆｏｒｍ

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ｐｌａｔｆｏｒｍ，

ｃｏｍｂｉｎｅｄ

ｗｉｔｈｄｏｕｂｌｅ—ａｎｔｉｂｏｄｙｓａｎｄｗｉｃｈｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｒｅｓｐｏｎｓｅ

ｔｏ

ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，

ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ

ａ

ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｋｉｔｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｓｅｒｕｍａｌｐｈａ－ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ．

Ｔｈｅｓｐｅｃｉｆｉｃｓｔｕｄｉｅｓａｎｄｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ

ａｒｅａｓ

ｆｏｌｌｏｗｓ：

１．Ｋｉｔｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｃｅｓｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇｓｅｌｅｃｔｉｏｎｏｆｒａｗ

ｍａｔｅｒｉａｌｓ，ｃｏａｔｅｄｍａｇｎｅｔｉｃｐａｒｔｉｃｌｅｓ，ｅｎｚｙｍｅ

ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，ａｎｄ

ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ

ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ

ｏｆｃａｌｉｂｒａｔｏｒｓ，ｋｉｔｒｅａｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ，ｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｎｏｒｍａｌｒｅｆｅｒｅｎｃｅｖａｌｕｅｓａｎｄ

ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．

ＩＶ

Ａｂｓｔｒａｃｔ

Ｍａｇｎｅｔｉｃｐａｒｔｉｃｌｅｓｃｏａｔｅｄ

ｐｒｏｃｅｓｓ：Ｔｈｅ

ｓｅｌｅｃｔｉｏｎｏｆｓｏｌｉｄ

ｐｈａｓｅｃａｒｒｉｅｒｋｉｔ

ｃａｒｂｏｘｙｌｍａｇｎｅｔｉｃｐａｒｔｉｃｌｅｓ，ｃｏａｔｅｄｔｗｏ—ｓｔｅｐｍｅｔｈｏｄｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｃａｒｂｏｘｙｌ；

Ｒｅａｃｔｉｏｎｋｉｔｆｉｎａｌｌｙｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｔｏｂｅ：Ｔｈｅｔｗｏ－ｓｔｅｐｒｅａｃｔｉｏｎｍｏｄｅｌ，ｔｈｅｆｉｒｓｔ

ｓｔｅｐ：

２５１ｘｌｓａｍｐｌｅ＋２０Ｉ．ｔｌ

ｍａｇｎｅｔｉｃ

ｐａｒｔｉｃｌｅｓ＋５０“１ｄｉｌｕｅｎｔｓｏｌｕｔｉｏｎ，ａｎｄｉｎｃｕｂａｔｅｄｆｏｒ１５ｍｉｎ

ａｔ３７℃，ｗａｓｈｅｄ６ｔｉｍｅｓ；ＳｔｅｐＴｗｏ：Ａｄｄ１００“１ｅｎｚｙｍｅｃｏｎｊｕｇａｔｅ，ｉｎｃｕｂａｔｅｄ

ｆｏｒ

１５ｍｉｎａｔ３７℃，ｗａｓｈｅｄ６ｔｉｍｅｓ；ＡｄｄｔｈｅｓｕｂｓｔｒａｔｅＡ，Ｂｅａｃｈ５０ｔｘｌ，ａｆｔｅｒｍｉｘｉｎｇ，

ｍｅａｓｕｒｅｄｗｉｔｈｉｎ５－１０ｍｉｎａｗａｙｆｒｏｍｌｉｇｈｔ．

Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｒｅｆｅｒｅｎｃｅｖａｌｕｅｓ：ｔｅｓｔｉｎｇ６１５ｎｏｒｍａｌ

ｐｅｒｃｅｎｔｉｌｅｔｈｅ

ｓａｍｐｌｅｓ，ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ

ｂｙ

ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ

ｖａｌｕｅ１０．０ｎｇ／ｍ１．

ｏｎ

Ｓｔｕｄｙｏｆｓｔａｂｉｌｉｔｙ：ｔｈｅｓｔｕｄｙｉｎｃｌｕｄｅｔｈｅａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄｓｔａｂｉｌｉｔｙａｎｄｒｅａｌｓｔａｂｉｌｉｔｙ

ｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔ．Ｏｎｅｓｗｅｒｅｐｌａｃｅｄａｔ３７℃ｆｏｒ１０ｄａｙｓ

ａｎｄｔｈｅｏｔｈｅｒｓ

ｗｅｒｅｓｔｏｒｅｄａｔ２～８

ａｒｅ

℃ｆｏｒ１４ｍｏｎｔｈｓ．Ｔｈｅｎｔｅｓｔｉｎｇｔｈｅｋｉｔ．ｔｈｅｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｉｎｄｉｃａｔｏｒｓｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ

ａｂｌｅｔｏｍｅｅｔｔｈｅ

ｐｒｏｄｕｃｔｉｓ

ｏｆｐｒｏｄｕｃｔｓｔａｎｄａｒｄｓ．Ｉｔｉｓｓａｆｅａｎｄｒｅａｓｏｎａｂｌｅｔｈａｔｔｈｅ

ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ

ｔｏｂｅｖａｌｉｄｆｏｒ１２ｍｏｎｔｈｓａｔ２～８℃．

２．Ｆｏｒｔｈｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｋｉｔｆｅａｔｕｒｅｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｔｈｅｍｉｎｉｍｕｍｄｅｔｅｃｔｉｏｎｌｉｍｉｔ，ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ａｃｃｕｒａｃｙ，ｄｏｓｅ—ｒｅｓｐｏｎｓｅｏｆｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎ．

ｃｕｒｖｅ

ｌｉｎｅａｒｉｔｙ，ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ

ａｎｄｏｔｈｅｒ

ａｓｐｅｃｔｓ

Ａｃｃｕｒａｃｙ：Ｗｉｔｈ

ｔｈｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅｍａｔｅｒｉａｌｓａｍｐｌｅｓ

ｆｏｒ

ｔｅｓｔｉｎｇ，ｔｅｓｔｋｉｔａｃｃｕｒａｃｙｏｆ

ｔｈｅａｖｅｒａｇｅｒａｎｇｅｉｎｔｈｅ０．９００～１．１００．

Ｔｈｅｌｉｍｉｔｏｆｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：Ｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｌｉｍｉｔｉｓ

Ｄｏｓｅ．ｒｅｓｐｏｎｓｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ

ｃｕｒｖｅ

ｎｏｔｇｒｅａｔｅｒ

ｔｈａｎ１．８ｎｇ／ｍ１．

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ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ

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ｋｉｔｓｈｏｕｌｄｂｅ三０．９９００．

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Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ：ｔｈｅｓａｍｐｌｅｓｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅｒｅｐｅａｔａｎｄｉｔｓｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｏｆｖａｒｉａｔｉｏｎ（ｃｖ）ｓｈｏｕｌｄ

Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎｂａｔｃｈｅｓ：ｂａｔｃｈｅｘｃｅｅｄ１５．Ｏ％

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ｎｏｔｅｘｃｅｅｄ１

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０％．

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ｏｆｖａｒｉａｔｉｏｎ（ＣＶ）ｓｈｏｕｌｄｎｏｔ

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（５００ｎｇ／ｍ１）ｈａｄ

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ｃｒｏｓｓ—ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ．

Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ：５０ｍｇ／ｄｌｂｉｌｉｒｕｂｉｎ，８１ｍｇ／ｄｌｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ，３０００ｍｇ／ｄｌｌｉｐｉｄｓ

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甲胎蛋白（ＡＦＰ）是１９６５年Ｂｅｒｇｓｔｒａｎｄ和Ｃｚａｒ在人胎儿血清中发现的一种胚胎专一性甲种球蛋白。ＡＦＰ是单一多聚体肽键蛋白，由５９０个氨基酸组成，分子量约７０ｋＤ，含糖４％。ＡＦＰ主要由胎肝和卵黄囊合成，其次是胃肠道粘膜，肾脏也可少量合成【ｌ】。胎儿６周开始合成，１２～１５周达高峰，出生后ｌ～２年降至成人水平。成人在发生肿瘤和妊娠时会出现ＡＦＰ浓度的升高。

ＡＦＰ是迄今为止发现的原发性肝癌最灵敏、最特异的肿瘤标志物，７０．９５％的原发性肝癌患者呈现ＡＦＰ水平升高１２Ｊ。

通过观察血清ＡＦＰ的动态变化可了解患者病情进展状态。治疗后病人血清中浓度的下降通常预示着成功的治疗，而浓度上升则相反提示肿瘤组织的残留或复发【３＇４】。

ＡＦＰ水平升高也可见于多种非恶性疾病：如：运动失调性毛细血管扩张症、遗传性高酪氨酸血症、新生儿高胆红素血症、急性和慢性病毒性肝炎、肝硬化、先天性胆道闭锁症，毛细血管扩张障碍等均可不同程度的增高。妊娠时会出现ＡＦＰ浓度的升高。孕妇血清异常升高提示胎儿脊柱裂、无脑儿或者多胎１５‘７Ｊ。ＡＦＰ降低提示未出生的婴儿有Ｄｏｗｎ’ｓ综合征的危险性。

检测血清ＡＦＰ含量是诊断原发性肝癌的重要手段之一。由于方法学的不断改进，使原发性肝癌的阳性检出率达到了８５—９０％以上。正常成人血清ＡＦＰ含量各家报告不一致。可能与测定方法、标准品等不同有关。中国肝癌研究协会报导正常人血清ＡＦＰ＜２０ｎｇ／ｍｌ。而原发性肝癌患者血清ＡＦＰ多数在５００ｎ∥ｍｌ左右［１９１。目前国内多采用１９７７年全国肝癌防治协作会议拟定的单项ＡＦＰ诊断肝癌的标准：定量≥５００ｎｇ／ｍｌ，持续一个月以上，并能排除妊娠，活动性肝病，生殖腺胚胎性肿瘤等。

通过观察血清ＡＦＰ的动态变化可了解患者病情进展状态，因为血清ＡＦＰ升高常在患者症状和体征出现数月之前，故ＡＦＰ检测对原发性肝癌具有早期辅助诊断价值。Ｋｗａｔａ等检测一例肝癌患者血清ＡＦＰ仅３１ｎ∥ｍｌ［２０１，一年后即达１００００ｎｇ／ｍｌ。Ｐｕｒｒｅｓ报导一例血清ＡＦＰ为３００ｎｇ／ｍｌ的患者，经尸检证实其肝癌结节的直径仅Ｏ．５ｃｍ。上海１９７１～１９７６年普查１９６万人，发现３００例肝癌，其中１３４例为无明显肝癌症状和体征的早期病人。普查发现的临床前期病人，经手术

前言

证实８１．６％为＿＜５ｃｍ的小肝癌【２¨。以上的结果提示：ＡＦＰ检测用于普查可早期发现原发性肝癌。此外检测ＡＦＰ还可作为治疗效果的评价指标。

若ＡＦＰ小于２０ｕｇ／Ｌ者，原发性肝癌基本不可能；在１００－－３００ｕｇ／Ｌ之问者必须进行随访，密切观察ＡＦＰ的动态变化，注意可能的小肝癌ＡＦＰ在３５０一５００ｕｇ／Ｌ，或含量明显增高者，必须参考其他检查，应高度警惕原发性肝癌的可能；如ＡＦＰ为５００—１０００ｕｇ／Ｌ，且含量在短期内不断升高，原发性肝癌可能性很大，但必须建议做活检；ＡＦＰ大于１０００ｕｇ／Ｌ者，甚至在近期内ＡＦＰ含量迅速升高，则原发性肝癌诊断基本可确定。ＡＦＰ阳性患者进行ＡＦＰ动态或定期检查，有助于了解病情的发展。在手术切除化疗、微波、乙醇注射等治疗有效时，肿瘤缩小，ＡＦＰ下降；如果肿瘤缩小而ＡＦＰ上升，说明肿瘤发生转移或播散。高水平ＡＦＰ岔气能够表示预后不良或治疗反应差。对于肿瘤切除患者，术后ＡＦＰ降至２０ｕｇ／Ｌ以下者，是预后明显优于未降至『Ｆ常者。

活动性肝病与肝癌的鉴别主要是ＡＦＰ的动态观察，在活动性肝病中肝细胞再生时ＡＦＰ的升高是一过性的，且常常与ＡＬＴ（丙氨酸氨基转移酶）的活动性变化相平行。但在我国，活动性肝炎及肝硬化患者癌变的危险性很大，ＡＦＰ持续性升高可能预示患者处于早期癌变阶段，需要密切监测病情变化，对于早期发现肝癌有重要意义。慢性重型肝炎的发生过程中，大量肝细胞发生变性坏死，同时甲胎球蛋白有关基因被激活，出现肝细胞的再生，对受损肝脏加以修复，其修复活动能力的强弱可以通过ＡＦＰ值的高低加以判断，较高水平ＡＦＰ一定程度反映肝细胞再生活跃，预示有较好的转归，ＡＦＰ的半衰期仅有３．５～６

ｄ【２２１。

血液中甲胎蛋白水平对于肿瘤的早期发现，病情的发展、治疗后的评价、监测复发和转移等方面都具有一定的应用价值，可以为患者争取治疗时间，延长患者生命。其临床诊断价值已得到广泛认可，随着试剂灵敏度的不断提高，其临床应用价值也更为广泛。

目前国内ＡＦＰ的检测主要是胶体金免疫层析试验（ＧＩＣＡ）、酶免疫法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫法（ＲＩＡ）、化学发光免疫法（ＣＬＩＡ）。

胶体金免疫层析试验（ＧＩＣＡ）：１９９７年采用胶体金标记Ｍｅ—ＣＥＡ，以硝酸纤维素膜为载体进行层析检测ｃＥＡ的技术。其试剂稳定、易于保存，附有质控带可行质量监控，是适合基层单位检测，操作简易快速、无须仪器设备的良好检测方法，但灵敏度稍低，只适合初筛。

固相ＥＬＩＳＡ试验：７０年代初ｓｔｅｍｂｅｒｇｅｒ等首先使酶标记技术检测获得成功。在

２

前吉

此基］ｉ￥Ｉ－Ｅｕｇｖａｌｌ等及Ｗｅｅｍａｎ等几乎同时在瑞典和荷兰建立了使用固相载体进行实验的酶免疫实验（ＥＩＡ）。至ＩＪｌ９７４年Ｖｏｌｌｅｒ在ＥＩＡ基础上发展了一种用微量反应板作为固相载体的ＥＩＡ，即后来被称为的酶联免疫吸附实验（ＥＬＩＳＡ）。１９７８年ＷＨＯ在我国上海和北京分别举办了ＥＬＩＳＡ技术培训班，将ＥＬＩＳＡ技术引入中国。由于ＥＬＩＳＡ具备保存时间长、无危害及污染、试剂稳定、可自动化检测等优点，得以迅速推广应用。目ｆｉ．ｉｆＥＬＩＳＡ检测各种肝炎病毒抗原抗体仍为较普遍应用的重要诊断条件。但该方法灵敏度和线性范围仍然难以达到临床应用要求。

放射免疫法：６０年代末，建立了第２代标记技术；放射免疫法（ＲＩＡ），它的标记物是核素（同位素）。核素具有放射性．并可用特殊仪器进行精确的定性测定。其检出界域达到ｎｇ－’ｐｇ水平，同时由于正常组织不存在放射性，因此没有了非特异放射性的干扰，有比较理想的特异性。根据测定反应产物的放射性强弱．可以精确地推算出被检抗原或抗体的含量。８０年代以来，固相放射免疫测定（ＳＰＲＩＡ）广泛应用于微量可溶性抗原抗体的检测，也可用于固体组织免疫组化的检测．敏

感度达到ｎｇ～纠ｍ１水平。但是，ＲＩＡ仍然存在一些不足，首先用于测定放射性粒

子的记录仪器十分昂贵，而且因放射性对操作人员有一定的危害性，受半衰期限制，标本无法长期保存，这就限制了ＲＩＡ的广泛应用，目前在中国的临床诊断市场上逐渐衰落。

化学发光免疫法（ＣＬＩＡ）：１９７６年Ｓｃｈｒｏｅｄｅｆ报道异鲁米诺标记生物素进行化学发光测定。发光免疫分析得到迅速发展，并有化学发光酶免疫分析，生物发光酶免疫分析和最近发展的电化学发光免疫分析，探测灵敏度得以迅速提高。其类型有（１）化学发光免疫分析：标记物为单一的化学发光试剂；（２）酶促化学发光免疫分析：酶和化学发光免疫分析相结合，发光时间延长，信号进一步放大。（３）电化学发光免疫分析：电化学发光反应在电极表面周而复始的进行，光信号明显增强。目前因为化学发光检测技术灵敏度高，特异性强，检测范围宽，试剂稳定和无放射性污染等优点得以在国内外市场上广泛推广，主要应用于半自动和全自动化学发光免疫检测技术上。

磁微粒化学发光法：磁微粒化学发光技术是将免疫磁珠体系、化学发光体系与免疫反应体系相结合，用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术。它既具有放射免疫的高灵敏度，又具有酶联免疫操作的简便、快速特点，易于自动化操作。在测试中不使用有害的试剂，试剂保质期长，应用于生物学，医学研究和临床实验诊断工作，成为非放射性免疫分析法中最具发展前途、最

３

网舌

为先进的检测方法。

作为新一代体外渗断技术基础平台，它所具有以下其他载体不可比拟的优

点：

１、免疫磁珠具有高的表面质量比，可以结合更多的抗体参加免疫反应；２、免疫磁珠表面通过共价键结合抗体，较物理吸附更坚固；

３、免疫磁珠由于粒径很小，在温育过程中，均匀分散在反应液之中，近似于均相反应，反应快速、高均一性；

４、免疫磁珠的超顺磁性在后期洗涤分离过程中更利于全自动仪器应用。

在国外，磁微粒化学发光技术方法兴起子２０世纪８０年代，目前在欧美等发达国家已经成为了临床实验室广泛使用的检测技术，己进入全自动化学发光时代。而国内刚处于市场导入阶段，目前在国内市场上推广的磁微粒化学发光诊断产品均为国外进口产品，如：ＲＯＣＨＥ、ＡＢＢＯＴＴ、ＢＥＣＫＭＡＮ

ＣＯＵＬＴＥＲ

公司等。我国在磁微粒化学发光检测技术上同欧美等发达国家相比还有很大差距。

国内目前的化学发光技术主要基于微孔板为载体的技术，测试时问较长，不易自动化等缺点。目前磁微粒化学发光技术在国内的研究处于起步阶段。

自２００８年起，郑州安图绿科生物工程有限公司开始立项磁微粒甲胎蛋白（ＡＦＰ）化学发光免疫检测系统的研发工作，历经３年时间完成本检测系统的研制工作，并通过了中国药品生物制品检定所质量检定，预计２０１１年８月份能获得国家食品药品监督管理局（ＳＦＤＡ）生产批文，从而进入临床应用阶段，以适应检验医学的不断进步。

４

材料‘Ｊ设备

材料与设备

１、材料：

鲁米诺（Ｌｕｍｉｎ０１）购自Ｓｉｇｍａ公司

对碘苯酚（ＰＩＰ）

购自Ｓｉｇｍａ公司

辣根过氧化物酶（质量标准ＲＺ≥３．Ｏ）购自Ｓｉｇｍａ公司牛血清白蛋白上海泽龙生物工程公司。

聚苯乙烯微孔板深圳金灿华公司化学发光微孔板。磁微粒

购自ＭＥＲＫ公司

２、主要设备：

化学发光发光检测仪安图仪器ＬＵＭＯ

化学发光发光检测仪奥地利Ａｎｔｈｏｓ公司Ｌｕｃｙ２

全自动化学发光发光检测仪ＢｅｃｋｍａｎＡｃｃｅｓｓ２

全自动化学发光发光检测仪ＲｏｃｈｅＥｌｅｃｓｙｓ２０１０

洗板机安图仪器ＩＷＯ

洗板机

奥地利Ａｎｔｈｏｓ公司Ｆｌｕｉｄｏ

ＰＨ计

Ｂｅｃｋｍａｎ高速冷冻离心机Ｂｅｃｋｍａｎ

包被机芬兰Ｌａｂｓｙｓｔｅｒｍｓ

分析天平岛津ＡＷ２２０型分光光度计

北京，ＵＶ－７４０型。

３、主要试剂

①甲胎蛋白定量检测试剂盒（化学发光法）：郑州安图绿科生物工程有限公司提

供，批号分别为２００９０１０５，２００９０７１５，２０１００１１２，２０１００５２１；规格为４８人份／盒，保存条件：２～８℃

②甲胎蛋白试ｊ｝ＩＪ（ＡＦＰ）：购自Ｂｅｃｋｍａｎ，批准文号为国食药监械（进）字２００９第

３４０１９８６号用于全自动化学发光仪ＡＣＣＥＳＳ２

５

材料‘ｊ设备

③包被磁微粒抗．ＡＦＰ抗体：购自伊美诺生物

④抗．ＡＦＰ．Ａｂ．ＨＲＰ：购自伊美诺生物⑤ＡＦＰ抗原：购自伊美诺生物

４、主要试剂的配制

（１）化学发光工作液：将Ｌｕｍｉｎｏｌ、Ｈ２０２、ＰＩＰ储备液以ＰＨ８．５的０．０５ｍｏｌ／１的＂Ｉｒｉｓ．ＨＣＩ溶液稀释成不同浓度。

（２）ＨＲＰ溶液：称取４００ｕｇ的ＨＲＰ溶于２ｍｌｐＨ８．４的硼酸盐缓冲液中，加三蒸水定容为１０ｍｌ，即得到１＂１０．６ｍｏｌ／ｌ的ＨＲＰ溶液；取此溶液用三蒸水稀释，使其终浓度为１幸１０．８～１木１０．１８ｍｏｌ／ｌ。

（３）酶结合物的制备：采用改良的过碘酸钠法制备。用含１０％的牛血清ＰＨ＝７．４的０．０５ＭＰＢＳ作为酶结合物稀释液。将酶结合物稀释到所需比例。

５、实验标本来源及保存

收集各临床标本合计１１７３例，标本采集后在室温下放置时间不能超过８

小时，如果采集当天不能检测应放置２．８。Ｃ冰箱中，长时间保存必须放置．２０℃。冻存的标本复融后应充分混匀，有不溶物的应离心去除，避免反复冻融。其中正常人标本１３０例，肝癌组标本１５０例，肝炎组标本１５７例，肝硬化组标本１４０例，其他肿瘤组标本２３５例，正常妊娠组标本１２９例，潜在干扰标本组１６０例，肝癌术后两周组标本３６例，肝癌术后复发转移组标本２１例，肝癌术后无复发转移组标本１５例

６、临床研究数据统计分析方法

采用ＳＰＳＳｌ３．０统计分析软件进行数据处理和统计分析。采用卡方检验进行统计分析，比较两试剂盒的符合程度。采用线性回归分析，分析两试剂盒检测结果的相关性。

６

实验方法和实验结果

实验方法及实验结果

“

第一部分主要原材料的研究

磁微粒化学发光免疫检测系统项目的研究丌发工作是基于我实验室已有的微孔板式化学发光免疫检测平台的基础之上的，此次研究开发的一个重要工作是将原微孔板式化学发光检测平台转化为磁微粒化学发光检测平台。因此此项目的主要原材料研究主要包括磁微粒抗体包被技术的研究、酶标记抗体的筛选配对研究和校准品体系的建立研究。

一、磁微粒包被抗体和酶标抗体的配对筛选

由于我实验室已有微孔板式化学发光免疫检测平台技术基础，几年来得到了临床的广泛认可，在生产和使用过程中未发生质量问题，因此首选其包被抗体材料用于磁微粒化学发光免疫检测系统项目的应用研究，对其性能进行验证，如果未达到预期性能再选用其他原材料。

１．包被方法的选择

首先对包被工艺方法进行选择，将ＡＦＰ包被抗体按照磁微粒包被技术平台的四种连接方法进行包被。包被后进行对比试验，结果如下：

表７．１磁微粒包被方法对比

校准品

ＢＯ

Ｂ０

ＮＨ２一一步法

１０２

ＮＨ２．两步法

７６．２

ＣＯＯＨ．一步法

５４．６５２．８

２３７

ＣＯＯＨ一两步法

４７．７４３．５８５

２１３０．３７５

９４．８３６３．６

２１６３

６８．４

１３２５．４

１０５０

１００

８５２８．４１５３６７．２

８０４２３．４

１９７２．２

４０９０．８２７５７１．２

１４０５８－３５２９６５８．７１２１６４９．５

１９５２２０．５

４７５３．２２９３２０．２４４７７５

Ｙ＝

５００

１０００

１４４３７５．６

Ｙ＝

４３６１４．６

Ｙ＝１．１４４４ｘ＋

标准曲线方

程相关系数

１．０６８２ｘ＋１．０１５５ｘ＋

Ｙ＝０．９７７８ｘ＋２．４３１４

Ｒ＝０．９９５４

１．５１６７

Ｒ＝０．９９８ｌ

２．１４９１

Ｒ＝０．９９８７

１．２９２４

Ｒ＝０．９９７ｌ

从上述结果可以看出，四种包被方法均有一定的反应性，且标准品也成线

７

实验方法和实验结果

性，相关性均能满足要求，且两步法包被明显较一步法包被的反应性强，但比较而言第四种羧基两步法包被反应性最强，更利于产品研发中反应条件的优化和性能指标的提高。重复３．５次包被试验后结果相似，因此选用羧基两步法进行

包被。

２．包被抗体和标记抗体效价测定

用常用的酶稀释液将ＨＲＰ标记的ＡＦＰ抗体进行倍比稀释１：５００、１：１０００和

１：２０００。在包被有ＡＦＰ抗体的磁微粒（Ｏ．６“卵，１．０９卵，１．４斗卵）上分别加入

三种浓度的酶标抗体，温育３０分钟后洗涤，再加入底物５分钟后测量结果见表

７．２－

表７．２包被抗体和酶标抗体效价测定

样

本

ＯＯ

Ｏ．６ｐｇ厂ｒ８５．０

１／５００１．０ｐｇ厂ｒ３８．５３９．６

４９．１２７４６．８

１．４ｐｇ／Ｔ３７．７３８．８

１／１０００１／２０００

１．４９９／Ｔ

０．６９卵

５９．５５７．７５９．７

１．０ｐｇ厂ｒ２６．９２７．７３４．３

１９２２．７

０．６儿ｇ／Ｔ

４４．６

１．０ｒｔｇ／＇ｒ１．４９９ｆｒ

２６．４２７．１３３．７１８８４．３８８３６．３１８１０９．５

９００６０．９

２０．２

２０．８２５．８１４４２．０

１９．８２０１３

２５．２

８２．４８５．３

８５８．４

４３．２４４．８４５０．６２１１３．３

４３３１．Ｏ

Ｓｌ

Ｓ２Ｓ３Ｓ４Ｓ５Ｓ６

４８．１２６９１．８１２６２３．３

２５８７０．７１２８６５８．５

６００．９

２８１７．７

１４１３．２６６２７．３１３５８２．１

６７５４５．７

４０２５．３８２４９．６４１０２６．３８３２１８．９１３６５２．９５８０．１

１２８８１．０２６３９８．７１３１２８４．２２６６３００．５４３６８９．２１８５６．４

９０１６．７１８４７９．１９１８９８．９

１８６４１０．３

６７６２．５１３８５９．３６８９２４．２

ｌ３９８０７．８

５７７４．７２８７１８．４５８２５３．２９５５７．０４０６．１

２１５３８．８４３６８９．９７１６７．８

３０４．６

２６０９７４．５４２８１５．４１８１９．３

１８２６８２．１２９９７０．８

１２７３．５

１３７０１１．６２２４７８．１９５５．１

Ｐ１Ｐ２

３０５８２．４１２９９．５

２２９３６．８９７４．６

结果显示，包被抗体和标记抗体均有较高的效价，初步可以确定包被抗体的包被浓度不小于１ｇｇ／ｍｌ，酶标抗体的效价不低于１：５００，在后面的工艺研究中再确定其最佳工作浓度。

３标记率及分子比测定

标记率及分子比测定方法：将酶标抗体稀释６０倍后用分光光度法分别测定酶和抗体蛋白的含量，再用数学公式计算其标记率和分子比。

酶标抗体（ＨＲＰ浓度）＝Ａ４０３ｎｍｘ０．４（ｍｇ／ｍ１）＝Ｏ．４５２。ＩｇＧ含量＝（Ａ２８０ｎｍ－－Ａ４０３ｎｍｘ０．３）ｘ０．６２（ｍｇ／ｍ１）＝Ｏ．８３３。ＨＲＰ／ＩｇＧ（分子比）＝（３．４＂０．４５２）／０．８３３＝１．８４６

８

实验方法和实验结果

酶标记率＝Ａ４０３ｎｒｎ／Ａ：８０ｈｍ＝１．１３／１．６８２＝０．６７２

４．包被抗体蛋白浓度的测定’

用生理盐水将包被抗体稀释３０倍，充分混匀后，在紫外分光光度计检测。用生理盐水调零，测得：

ＯＤ２８０＝０．０８３

蛋白浓度（ｍｇ／ｍ１）＝Ｏ．Ｄ２８０Ｘ０．７５ｘ稀释倍数

＝１．８７ｍｇ／ｍｌ

５．标记抗体蛋白浓度的测定

用生理盐水将包被抗体稀释３０倍，充分混匀后，在紫外分光光度计检测。用生理盐水调零，测得：

ＯＤ２８０＝０．０８２５

蛋白浓度（ｍｇ／ｍ１）＝ＯＤ２８０Ｘ０．７５ｘ稀释倍数

＝１．８６ｍｇ／ｍｌ

６．功能性验证

将包被抗体按照初步制定的工艺进行包被，酶标记抗体用常用的稀释液按照初步确定浓度进行稀释，对最低检出量、分析特异性、重复性、线性和ＨＯＯＫ效应这些指标进行验证，结果如下：试验布局：

Ｏ

０

高值血清高值血清

５００ｎｇ／ｍｌＨＳＡ５００ｎｇ／ｍｌＨＳＡ１０００ｍＩＵ／ｍｌＨＣＧｌＯＯＯｍＩＵ／ｍｌＨＣＧ５００ｎｇ／ｍｌＰＲＬ５００ｎｇ／ｍｌＰＲＬ

Ｑ１Ｑ１ＱＩＱ１Ｑ１Ｑ１Ｑ１Ｑ１

Ｑ｝１Ｑ１１Ｑ２Ｑ２Ｑ２

Ｑ２Ｑ２Ｑ２Ｑ２

Ｏ

Ｏ

Ｏ

００

０

１０

５０１００５００１０００

Ｏ

０

Ｑ２

Ｑ２Ｑ２

０

９