肠道致病菌多重PCR快速检测体系研究

沙门菌属、志贺菌属、侵袭性大肠埃希菌、肠产毒素大肠埃希菌是常见的引起人类和动物细菌性痢疾和细菌性食物中毒的肠道致病菌.严重的危害着人类健康和牲畜的安全。因此。建立一种快速、简便、准确、特异地检测方法具有重要意义。目前常见病原菌的检验方法存在着检测周期长、工作量大、所需试剂多。而且假阴性率高。灵敏度低,或假阳性率高,特异性差等缺点。PCR技术提供了理想的

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中国公共卫生 20年 2月第 2卷第 2 07 3期

C i JP b c el e 2 0 o .3N . h n u l H a hFb 0 7V Z 2 o 2 i t参考文献

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迹象而终止传代。未能进行软琼脂集落形成和棵鼠成瘤实验。 细胞转化是细胞建系过程中重要的一步。建立永生细胞系是

的基础。可为研究氧致肺癌提供一个直接的途径。 细胞转化是少数细胞异常增殖的结果，而这种异常增殖与癌基因的激活和抑癌基因的失活密切相关【。a子是否 3粒】通过影响这两类基因而引起细胞转化甚至恶性转化，有待进一

[ 崔凤梅 . 1]苏世标，聂继华， .鼠气管一等大支气管上皮细胞的分离、鉴定和培葬[]中国辐射卫生。 0 5 1 ( )2 6 2 7 J. 20。4 4:4— 4 .【 K tn H F, aD . i A吐a M r￣ 2] ir a￣, i￣ t . J L L, 1 op . h ea e 2 i hz r tn￣ i o ao f￣msome re nrttah a e i ea elcl rse ll dt fr dc lsI a rcel pt llcl ut e x:e o￣ i hi u l, ce

c c o[]Cn r e a h 18,:6 1 4 4 . a l￣ J .ac R s r .964 4 3— 6 1 rn e ec 6 [ R s J, oe D T e￣ el o g l ge cr]C r 3] o R￣ sA nG . h m eu r i y fu ne[ . ut a b￣ o n a JOpnP r d 20 . ( )2 5 6 . i d aMe。 0 28 4:6—2 9

步研究。

收稿日： 0 6 51期 2 0 .6 0

(朱艳萍编辑

刘铁校对)

文章编号： O 1 5 02 0]20 1 . l0 . 8 ( 7 O . 9 2 0 0 2 0

中图分类号： 6 5 R4 . 4

文献标志码： A

【实验研究】

肠道致病菌多重 P R快速检测体系研究 C代娟。玉峰，潇李杨沙门菌属、志贺菌属、侵袭性大肠埃希菌、肠产毒素大肠提供的序列设计一对引物为：引物 1 5:一C G TT T - AC A CT CTC T G C T C A T T G一3引物 2 5一A T m : GTGA TTG C CG C一3。

埃希菌是常见的引起人类和动物细菌性痢疾和细菌性食物中毒的肠道致病菌.严重的危害着人类健康

和牲畜的安全[。 1]因此。建立一种快速、简便、准确、特异地检测方法具有重要意义。目前常见病原菌的检验方法存在着检测周期长、工作量大、所需试剂多，而且假阴性率高。灵敏度低，或假阳性率高， 特异性差等缺点。P R技术提供了理想的检测方法。本实 C验采用多重 P R方法，在同一反应体系中检测不同的细 C可菌.整个过程只需要 2 ,~3h应用前景广阔。1材料与方法

C T C CA A

14 2 D A模板的提取 . . N

采用热裂解法，取细菌培养液 10 .

ml置于 E pn o, p edd管中， 0/ n灭菌蒸馏水洗涤 2次， 800rmi,

最后用 1蒸馏水悬浮， ml隔水煮沸 1 n 8 0/ n离心 0mi. 0rmi. 01 n取上清。 0 mi。即为 D NA模板溶液。

14 3多重 P R扩增条件的优化通过多次试验先确定了 .. C变化较小的因索 bf rd T, uf。 N P再对影响较大的因索如 Mg l e C2 浓度、引物浓度、 a酶用量、 Tq模板浓度， 1个范围内做正交在

1 1实验菌株 .

肠炎沙门菌、阿柏丁沙门菌，鸡雏沙门菌。德

实验，再进行局部微调，最后调整退火温度和循环数参数等。取 P R产物 5及 D re参照物在含有 ( V) 1 C NA Makr G的%琼脂糖凝胶中电泳。电压 7电泳 4 n后在紫外灯下观 5v, 0mi察结果。

尔比沙门菌、鼠伤寒沙菌。氏志贺 2,氏志贺 2,氏志福 a福 b宋贺菌，枸缘酸杆菌，变形杆菌，河弧菌，金黄色葡萄球菌，草枯芽孢杆菌 ( J省疾病预防控制中心 )产毒索大肠埃希菌四 I I; C32, 8 9 1产毒索大肠埃希菌 C 3 0 (国兽医药品监察所) 892中；侵袭性大肠埃希菌 (中国生物制品研究所)。 12试剂染料、 .缓冲溶液、 aD T q NA聚合酶、 N P、酸 d T s核染料 ( V)琼脂糖、 re等( G、 Makr北京塞百盛基因技术公司)。 13主要设备 . P R基因扩增仪、 C台式高速离心机、紫外可见凝胶成像系统、核酸分析仪、量加样枪 (国 E pn o 微德 p ed d公司)电泳槽、 Y; D Y一2稳压稳流电泳仪 (北京市六一仪器厂 )。 1 4方法 .

14 4多重 P R体系的特异性、敏度

、 .. C灵样品检测 ( ) 1特异性检测： 9株标准目的菌株和 7株非目的菌株，提取 D NA模板。然后进行 P R扩增， C电泳后观察有无条带的出现。 ( ) 2灵敏度检测：将从目的菌株提取的 D NA模板用核酸分析仪测定 D NA含量。然后作 1 O倍梯度稀释，每个稀释度的取 DN A进行 P R扩增， C电泳后观察条带的亮度，到不出现扩直

增带为止。( ) 3样品的检测：从牛肉中分离的可疑菌株，提取DN A模板，进行多重 P R扩增。同时， e按常规进行生化检验和玻板凝集试验。

14 1引物设计 ..

沙门菌组氨酸转运操纵子基因片段具有

14 5 P R试剂盒组成 . . C

经反复试验.组装多重 P R试剂 C

沙门菌属特异性[】根据 G nbn 17 2, eeakV0 3 3提供的基因序

盒。包括 P R反应管，C C P R反应液[染料，缓冲溶液( z ) Mg, dT, N P引物]琼脂糖粉， o Vi。 Gl e d w染料， a T q酶，阳性对照，阴性对照，液体石蜡。2结果

列设计引物，引物 1 5一A T G T T C vC即： C GC G T A C C T 1r TC G TG TG一3; f 2 5一A G1弓物： T GT CT CC CT G C G C G G G A一3由于 ia A p H基因存在于所有志贺菌属和侵袭

性大 …… 此处隐藏：1390字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……