Caspase 9 活性检测试剂盒(比色法)

Caspase 9活性检测试剂盒(比色法) (Caspase 9 Colorimetric Assay Kit)的检测原理是利用Caspase 9催化特异性底物 (Ac-LEHD-pNA)产生黄色的游离硝基苯胺pNA(p-nitroaniline),通过分光光度比色法测定pNA在400～410nm处吸光值,从而间接获得caspase 9的活性。

Caspase 9活性检测试剂盒(比色法)

简介：

Caspase 9又称ICE-LAP6、Mch6、Caspase-9，可以与细胞色素C和Apafl形成复合物并被激活，进一步激活下游的caspase 3，从而促进后续的细胞凋亡信号。Caspase 9活性检测试剂盒(比色法) (Caspase 9 Colorimetric Assay Kit)的检测原理是利用Caspase 9催化特异性底物 (Ac-LEHD-pNA)产生黄色的游离硝基苯胺pNA(p-nitroaniline)，通过分光光度比色法测定pNA在400～410nm处吸光值，从而间接获得caspase 9的活性。

操作步骤(仅供参考)：

1、 制备标准曲线：

① 按照Caspase Lysis buffer：Assay buffer=1:9的比例配制适量的标准品稀释液。 ② 用标准品稀释液稀释pNA(10mM)，另外设置一管不加pNA仅含标准品稀释液作

为零管，把以上系列浓度物质作为标准品。

③ 取pNA浓度分别为200μM、100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM 、0

的标准品各100 μl加入至96孔板或取适量体积加入至容量不超过100μl的比色杯，测定405nm处吸光值即A405。

④ 用每一个标准品的A405减去不含pNA的空白对照的A405，计算出实际的吸光值。

以每个浓度的标准品A405为x轴，以对应的pNA浓度为y轴，用Excel制作pNA浓度对A405值的标准曲线。

2、 样品裂解：

① 悬浮细胞：取实验样品和对照样品，离心收集细胞，小心吸除上清，同时确保尽量

没有细胞被吸除，PBS洗涤一次，再次小心吸除上清。按每2~10×106细胞加入Caspase Lysis buffer的比例加入Caspase Lysis buffer，重悬细胞沉淀冰浴裂解。 ② 贴壁细胞：弃细胞培养液，用胰蛋白酶消化贴壁细胞，收集至细胞培养液，离心小

心吸除上清，同时确保尽量没有细胞被吸除，PBS洗涤一次，再次小心吸除上清。按照每2~10×106细胞加入Caspase Lysis buffer的比例加入Caspase Lysis

Caspase 9活性检测试剂盒(比色法) (Caspase 9 Colorimetric Assay Kit)的检测原理是利用Caspase 9催化特异性底物 (Ac-LEHD-pNA)产生黄色的游离硝基苯胺pNA(p-nitroaniline),通过分光光度比色法测定pNA在400～410nm处吸光值,从而间接获得caspase 9的活性。

buffer，重悬细胞沉淀冰浴裂解。

③ 组织样品：按每3～10mg组织加入Caspase Lysis buffer的比例加入Caspase

Lysis buffer，冰浴上用玻璃匀浆器匀浆并转移至1.5ml离心管中冰浴裂解。 ④ 离心取上清至新的1.5ml离心管。立即测定Caspase 9的酶活性或-70℃保存样品。 3、 样品检测：

① 按照下表设置96孔板反应体系，溶液应按照顺序依次加入，即Assay buffer→待

② 孵育：盖紧96孔板孵育。肉眼可见颜色发生变化时，即可进行A405检测；如果颜

色变化不明显，可适当延长孵育时间甚至过夜。

③ 待测样品A405分别减去空白对照A405即为样品Caspase 9水解底物产生的pNA

吸光值，根据标准曲线即可获得酶的含量。

计算结果：

① Caspase 9酶活力单位的定义：在37℃一个小时内可以剪切1nmol Ac-LEHD-pNA

产生1nmol pNA的caspase 9的酶量。根据pNA标准曲线和样品A405值，可计算出Caspase 9酶活力单位。

② Caspase 9酶活性的另外一种表示方法是Caspase活性增加的百分比即实验处理

组A405/实验对照组A405×100%，简单而可靠，可粗略的反应酶活性情况。

注意事项：

1、 建议每次测定时都做标准曲线，以使标准更准确，另外标准品需避免反复冻融。 2、 如果没有酶标仪，也可以使用普通的分光光度计测定，但应考虑根据比色杯的最小检

测体积，尽量采用100μl体积以内的比色杯。

3、 所测样本的值高于标准曲线的上限，应用裂解液稀释样品后重新测定。

4、 样品蛋白有效含量过低或Caspase激活水平过低都会导致实际测得的A405过低，应注

意使蛋白浓度尽量达到1～3μg/ml，调整诱导凋亡的时间和条件。

5、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

有效期：12个月有效。