CTAB法提取Total_DNA原理

CTAB法提取Total DNA原理

CTAB法原理CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三

甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性，阳离子表面活性剂，呈白色或浅黄色结晶体至粉末状。易溶于异丙醇，可溶于水，熔于热水、乙醇、三氯甲烷，微溶于丙酮，不溶于醚和苯。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。

CTAB提取缓冲液的经典配方

Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；

EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；

NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，在于液相中

CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；

β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除

用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？

使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。

使用酚的优点：1.有效变性蛋白质；2抑制了DNase的降解作用。缺点：1.能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly(A)RNA。2.不能完全抑制RNase的活性。氯仿的作用？

氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。

最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中）

用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。

用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？

用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl 或NaAc （20mmol/L？）Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。

不同生物DNA的提取方法不尽相同，但各种提取方法也有很多相通之处，可以相互借鉴[3] 。

在DNA提取过程中应做到：

1、根据不同研究需要，保证结构的相应完整性；

2、尽量排除其它大分子成分的污染(蛋白质、多糖及RNA等)；

3、保证提取样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂及高浓度的金属离子。