现代预防医学2013年第40卷第6期ModernPreventiveMedicine，2013，Vol.40，NO.6

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癌基因PTEN在前列腺癌中可能的调控作用。2000转染试剂（美国Invitrogen公司）说明书进行。24h后提

取PTEN总RNA进行实时PCR反应，48h后提取蛋白质进行

1材料与方法1.1材料1.1.1

组织及细胞收集

Westernblot检测。1.2.4统计学方法

11份正常前列腺组织、6份前列腺癌

采用SPSS18.0统计软件进行数据分析。

实验所得数据以均数±标准差（±s）表示；独立样本采用t检验；单因素方差分析采用SNK-q进行多样本均数的两两比较。以P﹤0.05为差异有统计学意义。

组织均取自本院电切手术或前列腺穿刺标本并经病理证实。全部病例术前均未接受放化疗，标本采集后迅速放至液氮中冷冻，-80℃。前列腺癌PC-3系细胞（中国医学科学院基础医学研究所细胞中心），用含有10%的胎牛血清的RPMI1640培养基（美国Gibco公司），37℃温箱培养，隔日换液。

2结果

2.1miRNA-21和PTEN的表达

miRNA-21在正常前列腺组织、前列腺癌组织中的相对表达量分别为（0.033±0.018）和（0.421±0.166），正常前列腺

组织低于前列腺癌组织差异有统计学意义（t=-6.6，P﹤

1.2方法

1.2.1RT-PCR

Trizol法提取细胞及组织中的总RNA，紫外

分光光度计检测总RNA的吸光度A260和A280值，并保证

A260／A280比值为1.8～2.1以控制其纯度。取2μg总RNA作

为模板，miRNA-21、U6及编码基因PTEN的逆转录反应体系：2.5mmol／LdNTP2μl，1μmol／L逆转录引物1μl，4U／

0.05），表明miRNA-21在前列腺癌中高表达，见图1。PTENmRNA在正常前列腺组织、前列腺癌组织的相对表达量分别为（1.534±0.385）、（0.376±0.232），正常前列腺组织高于前列

腺癌组织，差异有统计学意义（t=5.8，P﹤0.05），见表2。

μlQuant反转录酶（Takara公司）1μl，5×逆转录酶缓冲液4μl，加无RNA酶水至反应体积为20μl。37℃温浴60min，95℃5min，收集cDNA，-20℃保存。miRNA-21茎环状逆转

录特异引物和miRNA内参照U6引物由Takara公司合成。

PTEN蛋白在正常前列腺组织、前列腺癌组织中的相对表达量分别为（2.010±0.386）和（0.571±0.143），差异有统计学意

义（t=12.3，P﹤0.05），见图2，3

。

miRNA-21及PTENPCR反应体系：取lμlcDNA为模板，SYBRGreenRealTimePCRMasterMix（Takara公司）9μl，上下游引物各2μl，无RNA酶水加至20μl。PCR反应参数：预

变性95℃30s（1次）；变性95℃10s退火60℃20s延伸

70℃2min（共30循环）；70℃10min延伸、补全。miRNA-21逆转录引物序列5'-GTGGTATCGAGAGCTGCGTG-GCAGGTATTCCCACTGGTTACGACTGAACA-3'；内参照U6引物序列5'-GTCGTATCGTGAGCAGCGTCCGAGGTATTCGCACTGGATAGCACAAAAATATG-3'。miRNA-21PCR反应的上下游

引物分别为5'-GCGCGCTAGCTTATCAAGCTGATG-3'和5'-

GTGCAGGCTCCGAGGT-3'；内参找U6的上下游引物5'-GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3'和5'-GTGCAGGGTCCGAGG-3'。PTEN上、下游引物序列分别为5'-GAGGGAATAAACAC-CATG-3'和5'-AGGGGTAGTGAGTGACACAGTA-3'。内参照β-actin上下游引物序列分别为5'-CAGAGCCTCGCCTTTGCC-3'和5'-GTCGCCCACATAGGAATC-3'。按目的基因的表达量=2-△△Ct计算各个样本中的miRNA及mRNA的含量。△Ct=目的基因Ct值-内参基因的Ct值。

1.2.2Westernblot检测蛋白的表达将收集组织或细胞加入500μl裂解液［含150mmol／LNaCl、10mmol／LTris—HCI（pH7.5）、0.1％SDS、1％NP-40和蛋白酶抑制剂复合］中匀浆后超声波室温破碎10min，12000r／min离心10min，收集裂解物的总蛋白。BCA蛋白定量法测定蛋白质的浓度。取40μg总蛋白进行Westernblot，PTEN一抗为鼠抗人单克隆抗体（1︰300稀释，美国XYMED公司）及3-磷酸甘油脱氢酶

（GAPDH）一抗羊抗鼠（1︰400稀释，美国Promad公司）。辣根过氧化物酶偶联的二抗为羊抗鼠（1︰5000稀释，美国

图1mRNA-21

在不同前列腺组织中的表达

Abcam公司），按步骤进行曝光、显影及定影，然后扫描胶片，

用GENEGENIUS凝胶图像处理系统分析各条带谱带强度值。

1.2.3细胞转染取稳定生长的对数期PC3细胞，消化后以

图2

3×105／孔种植于6孔细胞培养板。设置空白组、转染组及阴性对照组。空白组加无血清培养基，转染组加50nmol／L的miRNA-21inhibitor（广州锐博公司），阴性对照组加入浓度为50nmol／L阴性对照剂（广州锐博公司），按Lipofectamine

PTEN在不同前列腺组织中的表达

2.2转染miRNA-21inhibitor后miRNA-21和PTEN的表达

miRNA-21inhibitor转染PC3细胞后miRNA-21在空白