三羟异黄酮对辐射损伤小鼠骨髓基质细胞的保护(2)

发布时间：2021-06-05

第　三　军　医　大　学　学　报　　　　　　　　　　　　　　　第27卷472　　　　　　　　　　　　　　　　　

质量23～26g,随机分为3组,每组100只:①正常对照组(Con2

trol);②辐射损伤对照组(R);③GEN+辐射损伤组(GEN+R)。给药方式:辐射前24h,GEN(西安交大保赛生物技术股份有限公司,纯度≥98%)以食用色拉油作为溶剂,按160mgΠkg给予灌胃,每只约011ml。小鼠装在弧形有机玻璃盒内,以60Coγ射线一次性全身照射,吸收剂量为610Gy,吸收剂量率为98168×10-2

GyΠmin。取辐射后1、3、7、14d和21d小鼠骨髓细胞(bone

marrowcells,BMCs)进行体外培养,分别对培养14d和28d的BMSCs进行检测。实验重复3次,每次实验均设正常对照组。

1.2　BMSCs培养

　　在各个时相点取20只小鼠双侧股骨制备BMCs,按常规方法培养BMSCs。

1.3　成纤维细胞集落形成单位(CFU2F)的培养

　　BMCs以含10%新生小牛血清、10%马血清、青链霉素各

100UΠml、1×10

-6

molΠL氢化考的松和IMDM培养液制备成1×106

Πml,混匀后接种于24孔板,每孔2ml,每组重复6个孔,37℃、5%CO2培养箱内培养,每周半量换液,第14天于倒置显

微镜下计数,由40个以上细胞组成的集落为1个CFU2F。

1.4　BMSCs贴壁层粘附能力测定

　　将上述骨髓CFU2F继续培养,第28天基质细胞层形成后,用PBS液轻轻冲洗2次,去除悬浮细胞后,各孔加入细胞浓度

为5×105Πml的含20%小牛血清的正常小鼠BMCs1ml,37℃、

5%CO2培养箱内孵育2h,用IMDM培养液轻轻冲洗2次,收集

并计数未粘附的BMCs,按照下列公式计算BMSCs对正常BMCs的粘附能力。

　　粘附能力=1-5×10

×100%。1.5　流式细胞仪检测BMSCs粘附分子的表达

　　BMSCs培养28d后,收集各组细胞,台盼蓝染色判定BM2

SCs的成活率为95%以上。采用间接免疫荧光法,在各样本管

中分别加入一抗(VCAM21、Fn和Ln等单抗);阴性对照用PBS代替一抗,4℃过夜离心弃上清,PBS洗3次。分别加FITC标记的二抗,37℃孵育30min,离心弃上清,PBS洗3次,FCM分析并计算各指标的荧光强度变化。

1.6　统计学处理

　　实验数据以 x±s表示,采用SPSS统计软件进行t检验。

2　结果

2.1　辐射损伤后BMSCs形态观察

　　光镜下,正常小鼠BMSCs呈梭形、多角形,胞浆丰富,胞体较大且伸展,伪足明显;胞核居中或偏位,呈圆形或椭圆形,核仁单个或两个以上;细胞贴壁快,呈漩涡状或平行样生长,21d长满培养瓶。辐射受损BMSCs形态不规则,胞体较短小,排列散乱,胞浆呈撕裂状,胞核不清楚;细胞增殖能力明显受抑,贴壁能力大大降低;随着培养时间的延长,在光镜下可看见一些结构模糊的变性细胞。特别是辐射后第3天,骨髓中有核细胞较少,细胞极少贴壁;辐射后第7天,细胞形态、贴壁能力才逐渐开始恢复,培养28d后细胞融合仍然较差。R组与GEN+R组的细胞形态差异不明显。

2.2　GEN对辐射损伤后CFU2F数量的影响

　　从表1可知,辐射后各时相点CFU2F形成数量均少于正常组,且恢复缓慢,直至辐射后21d,CFU2F形成数量仍低于正常

组,仅为正常的35%左右(P<0105)。与R组比较,GEN+R组

BMSCs贴壁能力较强且恢复较快。除辐射后第3、7天外,GEN+R组CFU2F数量高于R组(P<0.05)。

表1　小鼠股骨骨髓体外培养14dCFU2F的变化(n=20, x±s)

Tab1　ChangesofmurinebonemarrowCFU2Fculturedinvitro

for14d(n=20, x±s)

GroupPost2irradiationdays

1d3d7d14d21dControl112±21109±31119±19125±33117±27R23

±7a7

±1aq16

±6a24