植物体细胞杂交及其杂种鉴定方法研究进展

西北植物学报，0 72 ()00 -0 1 20,71;26 2 3Aca t Bo e l一)cd n . . t Bo . r a。〔ci e t S n i

文章编号：0 04 2 (0 70 -2 60 10-0 5 20 ) 100-8

植物体细胞杂交及其杂种鉴定方法研究进展张改娜，贾敬芬’(西北大学生物技术省级重点实验室，西安 706 ) 109

摘要：植物体细胞杂交使远缘杂交不亲和的植物有可能实现遗传物质重组，创造和培养植物新品种乃至新物种，尤其在多基因控制农艺性状的改良上具有较大优势。随着原生质体融合技术和现代分子生物学的发展，体细胞融合再生植株的植物种属范围不断扩大，杂种鉴定的方法和手段也有了很大提高。本文就近年来植物体细胞杂交的技术手段、筛选体系和杂种检测方法进行了综述，并展望了其应用和发展前景。关键词：体细胞；不对称杂交；杂种鉴定中图分类号： 93 1 Q 4.文献标识码： A

R sac P ors i Smai H bii t n eerh ges o t y r z i r n c d a o a d et i t n T e H bis Pa t n I nic i o hi y r i ln d f a o f r d nZ HANG a n,I Jn - n G i aJA gf ' - i e( rv c l y brtr o Boeh o g, tw s U i r t, a 70 6,h a Poi i K L oa y i cnl y N r et v syX 'n 0 9C i ) na e a o f t o oh nei i 1 n

A s atPat a c bizt n oie te si ly gnt ma r l o bnt n sx a bt c:l sm t h r i i p v s p s it o ee c t i rcm i i o eul r n o i y d a o r d h o b i f i ea e a o f cos no pt it p nsrsl i nvl n clvr a d n sei . a pn eat h rs- cm ai ly t, ut n epat t as ee nw c sI i peo drn tc- i bi l a e s o l ui n v e p e t r s e n u, c l fr rv g oo it i cnrld m lpe e. h avn o po p s i eep il o ipoi arnm c t ot l b u i gnsWi te et rt l t q se ay m n g r s o e y t l e

a t h d f o a fs n d l ua b l y h i e, oe c s b rgnrtd m m t h bii t n ad ui a m e l i o tcnq sm r sei cn eeeae f s a c r z i,n o n o c r g e o u p e a e r o i y d ao o m r h bi ae i i nie. s e rv w te n sm t h bi zt n h i e,e c o oe r s esy ti T i ppr i s p t ai y r i i tcn ussl t n y d r a l d fd h a e e e h l o c d a o e q a ei ad nict n s msa w la te ftr popc . n i ti i s t,s l hi uue set d fao y e e e s r r s K y rssm t cl ay me i h bi zt n h bi ieti t n e w d: a c l sm t c r i i; r dnic i o o i e; r y d a o y d f a o

有性杂交是通过雌雄配子结合， 实现双亲遗传物质转移和重组的常规育种手段。这一育种技术在植物育种工作中发挥了巨大的作用。但是远缘杂交的有性不亲和、双亲花期不遇、雄不育等阻碍了雌/这一技术在植物育种中的应用。植物体细胞杂交

及定向转移胞质基因控制的性状和利用配子一体细胞杂交产生三倍体植物上显示出重要的应用前景，并对丰富种质、保持和促进生物多样性具有重大的

( m t hbiz i ) s ac r it n是以原生质体培养为基础， o i y d ao人工诱导使不同亲本原生质体融合，并通过对异核体的培养产生体细胞杂种的技术。它可以克服有性杂交遇到的前述障碍。体细胞杂交在转移抗逆性状，进行作物改良，实现远缘重组，创造新型物种，以收稿日期：060-8修改稿收到日期：0 61-8 20-7; 0 20-21

意义。利用体细胞杂交转移的基因为亲本自身所携带，不存在安全性问题。随着分子生物学的发展，在获得上述体细胞杂种的同时，体细胞杂交的技术、方法、检测手段等都得到了一定提高。

1原生质体杂交的植物种类2世纪 7年代至 8年代， 0 0 0随着原生质体培养

基金项目：国家自然科学基金资助项目(0767 3309)作者简介：张改娜(97,汉族)在读博士， 17-)女(,主要从事植物体细胞杂交和基因工程方面的研究。

,讯作者：芬，通贾敬教授。 -a:

8 n ue . E i i 3@ w . c m la jf j d n u

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1期

张改娜，:等植物体细胞杂交及其杂种鉴定方法研究进展

技术的不断改进，通过原生质体培养能再生植株的植物种类迅速增加。其中茄科( o nca) S l aee的烟草 a

21 E—高 p . G P H高钙法自2世纪 0 7年代中期， a等[1 0 K o 3建立起聚乙 3二醇( E )-高 p PG-一 H高钙法以来，直到 2世纪 9 0 0年代，所获得的体细胞杂种大部分是用该化学诱导法诱导融合产生的，后来又发展了电融合法和聚集微素激光法。但一直以来 P G法都被广泛使用， E聚

属( i t n)番茄属(yoe i m)]十字 N c i a[、 oa 1] L c rc}、 p su 2花科 ( rce e的芸苔属 ( rsc)]伞形科 Cuir ) fa B asa、 i[ 3 ( m eir ) U bl e e的胡萝卜 D uu) l a f属(acs4[等双子叶植=物，由于其原生质体培养较容易而被广泛应用于体细胞杂交研究。但在此期间，涉及目标性状转移的

研究很少仁]‘。随着不对称细胞杂交技术的建立和， 2发展，利用植物体细胞杂交技术转移目标性状以改良作物的研究成为研究的热点。体细胞杂交技术虽然有其随机性的缺陷，但可通过对称或不对称融合技术转移细胞核中的染色体组、染色体片段，或者细胞质中的叶绿体 D A和线粒体 D A, N N因而可利用的基因资源十分广泛。

集微素激光法应用极少。19年， 99夏光敏等_用 3 4 1 P G法诱导普通小麦与紫外线照射的高冰草原生 E质体融合，产生了具有优良性状的F代穗系。20 2 01年 Y e 1用 P G法将璋毛麦的耐盐性转移到普 u等〔 6 E〕通小麦。20年Wag 2采用P G法将用IA 05 n等[ 1〕 E O和紫外线分别处理的A aios t l n (.和 rb pi h i a ) d s a L a B perm roe fl m l. u l u s znr o u Wi融合， u c o i i l d形成科间不对称杂种并再生植株，染色体数目检测发现：紫

19年 L 5 等[不完全统计， 99 i]已用于育种目的的体细胞杂种植株从 1科、2 3个作物品种中 2 2属、3再生， 6%为种间的体细胞杂种。在这些融合其中 5组合中，供体所具有的目标性状包括抗冻[、 s抗干]旱[、 3抗病毒[、] 7耐真菌[、] 8抗虫[`MS01其] 9 C _

,等，] 1〕 1中融合的作物 9%以上为双子叶植物。同时国内 0外还开展了空间电融合技术的研究[ 1 2世纪[3 0 1飞 2, 8年代中期， 0单子叶植物原生质体再生植株相继被突破〔」开始对单子叶作物应用体细胞杂交进行改“,

外线照射的供体( . znr o u Wid) B s roe fl m l.的染 c o i i l色体完整存在，但是受体染色体却被排斥，只有少数

片段渗透到杂种细胞中。22电融合法 .用细胞融合仪产生交变电压和高压脉冲电场诱 导植物细胞融合，目前研究最热的物理诱导融合是

法。17年Sna5 99 ed[首次报道了植物原生质体可 3〕以在电脉冲作用下进行融合。Z m m n等[, i e en 3 7 m 6; 3又进一步发展了动植物细胞电融合的方法和仪器。由于电融合较之化学融合有操作简便、易子控制、副作用小、融合率高、应用范围广等特点。从 2世纪 0 8年代中期起， 0国外对动植物细胞电融合的方法和条件进行了大量研究，细胞杂交成功的例子相继被

良，如玉米与小麦间再生植株t . 20年后，"o 00 .体细胞杂交无论在双子叶还是单子叶植物中都有了长足

的发展，主要集中在禾本科[]芸香科〔、 1 1 s 1菊科「 7] 8]豆科[、 2、 1茄科[十字花科和伞形科[、 9] 0] 2百合科〔 1] 2 2]8个科、9 3个植物种中再生。除了上述目标 2属、6

性状，还增加了耐盐[、[吸收重金属[、 1 6 1 2药用成 3]

分2、[、质2等[抗虫2高品[性状，且这些体细 4] 5] 4〕而胞杂交中 8%为属间体细胞杂交。尤其是单子叶禾 5本科：小麦与其多种近缘属间植物进行体细胞杂交，不仅获得再生植株，而且这些新品系和株系存在一些优良的农艺性状，如高品质[, 2耐盐[和抗虫「 7] 2 8] 2 9〕等，此外还对小麦与高冰草属间杂交 F代[及小 2 2 7〕

报道[。随后植物原生质体电融合也相继成功并 3 8]获得多种杂种愈伤组织。S e a等F用电融合法 hr f 3 r 9 1诱导野生型番茄和耐盐系双单倍体土豆融合，得到再生植株，并得到介于双亲中间型的叶片和地下果

实，杂种的耐盐性降低了 5% e e等[用电 0 B w r 2 o r 3〕融合法诱导了植株矮小但可富积重金属锌和镐的 T lsiarl cn和植株较高大的B as a - hap ce e e、 us rsc n i a

麦和T i p r

m ncm的F-代[进行了 hn yu p tu o oi 3。 2 F 9〕研究，这些优良性状能够稳定遗传；高羊毛的 C MS

ps u融合，并得到在含高锌和镐的土壤中存活的再生植株，使通过体细胞杂交将高积累重金属品系的基因转移到其它植物中成为可能。他们同时对电融

通过体细胞杂交转移到多花黑麦草[; 3芸香科不同 0 1属间也获得了多种体细胞杂种〔. 33 1] 2

合参数进行了摸索，使电融合频率提高到 1%} 3 2 0世纪 8年代末， 0我国也开始采用电激法进行体细胞杂交。郑强等7对不同品种的白菜间进行了电融 4 0合试验；前华中农业大学作物遗传改良国家重点目实验室通过电融合法对属间柑橘进行融合，得到多

2体细胞融合的方法诱导异源原生质体融合产生异核体 (e r- ht o e kro) ayn即杂种细胞，是体细胞杂交程序的第一个关键环节。目前主要有以下两种方法。

种属间体细胞杂种..40世纪 9年代国内外 1. 2 31 0 27 0还同时开展了空间电融合技术的研究’〕, 23发现微，」

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重力环境可以改善细胞电融合技术，使电融合频率升高到 1., 88 0异核细胞的成活率也高于 5 0。电 0 0o融合操作方便，又避免了化学方法对原生质体带来的毒害，融合频率也大大提高，因而得到普遍应用。但原生质体融合的频率直接受电压大小、场强、脉冲强度和幅宽以及脉冲次数的影响，对于不同的植物材料，需要经过实验来找出这些参数的适当值。

获得了含 1条供体染色体的不对称体细胞杂种。但

Fr e os r 4在进行 Basa p、与 A ai b g等[ 5〕 rsc n u i a rb -d pitai a不对称体细胞杂交时使用了 7, os h l n s a 0 801 G 3 0, 30个剂量， 5 y结果 1 G对获得不对 30 5 y称杂种最有效。紫外线辐照原生质体的剂量一般为

10- 50 2Xa 6 0^4 Jm,等4用强度为 30 c 2 0/ i〕 8A m W/的紫外线辐照原生质体 05 m n . i后融合， -5发现辐照 2 3 n比辐照 0 5 n中的体细胞杂种分裂，m i . mi慢，且不能形成再生植株，辐照 5 n m则不能形成愈 i伤组织。在这种辐照产生的不对称杂种中，一般被辐照的供体 D A优先丢失， N但存在受体染色体被排斥的现象，而辐照供体的染色体却完整或绝大多数保留在杂种细胞中[

,, 42具体原因有待进一步 71]研究。

3体细胞融合体系的类型体细胞杂种按照融合产物的细胞核组分来看， 可以分为对称性和非对称性细胞杂种两类，非对称细胞杂种又分为核不对称和胞质杂种两类。一般来说，对称融合多形成对称杂种，其结果是在导人有用基因(或优良性状)的同时，也带人了亲本的全部不利基因(或性状)而非对称融合只转移部分核基因；或者只转移胞质内容物，从融合再生植株中挑选具有优良性状的植株，从而缩短育种时间；此外还可采用配子与体细胞杂交来产生三倍体植物。在原生质体技术发展初期，人们试图通过原生质体融合(对称体细胞融合)将两个亲缘关系较远的物种的基因组

4杂种细胞的筛选如何从含有双亲单细胞和同源融合细胞中筛选 出杂种细胞是体细胞杂交成功的另一关键技术。最初研究人员利用双亲原生质体的形态特征判断异核细胞，但准确度不高。对于难以用肉眼观察到差别的原生质体可用不同活性荧光染料标记，利用流式细胞计数仪可将荧光染色后的原生质体融合细胞高

结在起，合一创造新的植物类型。然而融合产物虽得到再生植株，但其可育性及形态特征趋于不正常化，且双亲染色体出现不可控性排斥与丢失，或者获得的体细胞杂种愈伤组织难以分化。而携带受体全部染色体和供体少数染色体或染色体片断的不对称杂种成为培育新种质的更有价值的材料，因此近年来不对称体细胞杂交已成为原生质体融合的热点。不对称融合方法的建立， 即通过物理或化学因子(常用的有 X射线、 y射线、紫外线、乙酞胺碘

效率地自动分离出来[,,[4此法由于仪器昂贵， 49 8]应用并不普遍。2世纪 8年代曾利用植物突变体间 0 0遗传互补原理选择杂种细胞及其愈伤组织，如两个营养缺陷型突变体杂交后可产生恢复正常表现的杂种；两个非等位基因突变产生的叶绿体缺失型突变体产生的杂种可能由于互补而产生恢复绿色表型的杂种愈伤组织和植株。Gea0 l[研究蓝茉莉叶烟草 b5」与颠茄不对称体细胞杂交时，利用代谢突变体为材料，受体为硝酸还原酶缺失突变体，依据硝酸还原酶的补偿性选择杂种。但由于筛选突变体历时长且较难获得，近年来应用并不多。随着分子生物学的发

( A,6一 I )R G罗丹明 6 ) O G处理供体原生质体，使供体亲本一方仅以胞质基因或部分核基因转移到受体一方，从而直接获得胞质杂种或不对称核杂种，为远缘杂交不

亲和的种间或属间的体细胞杂交创造了有

利条件，增加了获得可育再生植株的可能性[。目 4 2]前也有用紫外线辐射处理，并得到了较好的非对称

展，基因转化系被应用于体细胞杂交。Sm y v1 a ol[ o5]在进行番茄与茄子不对称体细胞杂交时，供体为卡那霉素转化系，但辐照使之钝化，不能分裂，而受体对卡那霉素敏感，只有具受体全套基因组和供体抗卡那霉素基因杂种才能在含卡那霉素的培养基上生长。我国夏光敏[,则利用融合产物的再生能力 55 2」 3互补法来选择杂种。即受体和供体愈伤组织都经过多年的继代，或供体经高剂量辐照后失去再生完整植株的能力，但融合产物具有再生完整植株的能力，从而获得杂种植株。近几年，一些学者[,通过化 55 45〕学试剂如 I A, a ie O R dm n 6G等钝化受体原生质 o -

杂交效果。Pau k 4建议用超致死剂量辐照 hdi等[ v 3]供体细胞或原生质体，使其染色体被击成“小片段”,然后与一个正常受体细胞或原生质体融合。在部分同源的适宜条件下发生重组，使供体染色体碎片“掺人”受体染色体中，从而形成具有受体整套染色体组，而仅有少量供体染色体片段的不对称杂种。辐照剂量因物种不同差异很大， X射线和“ o o Y C一射线

一般在10 00。如Bt等仁用10辐 0-1 G 0 y as“ 0G e〕 y照蓝茉莉叶烟草原生质体与普通烟草原生质体融合

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体，使其线粒体失活，而用物理辐照钝化供体原生质体使其核染色质受到伤害从而也失去持续分裂的能力，但融合后的杂种细胞由于生理互补可形成愈伤组织及植株，从而可以被筛选出来。这种筛选体系简单省时，获得的杂种植株由于都是亲本基因，不存在不安全因素，易于推广使用。

C cm s。白化突变体在 P R产物中只有 1 uu im l e C个酶切位点，从而获得 31和 33 2 8b y 1 b个片段， y亲本 C m r cru的这段序列则有 2 S u . i ap s yo个 a3 A酶切位点，其中一个位点将 31 8b y的片段又分为 24 2 b和 17。这样拟在杂种中， y 5b y只要同时存在这 5

个段，可以定杂 L等’。[片就确为种。 i .和F等s u〕 o]也通过此法鉴定并确定了属间体细胞杂种。随机扩增多态性 D A技术( A D即一段与 N RP)某一单一引物

(一般为 1 0聚体引物)同源的 D A N序列，有可能在 D A模板的不同位置出现， N这些位置之间的距离又处于可通过 P R进行扩增的长度 C范围，因此，当条件满足时，单个寡核昔酸引物就可

5体细胞杂种的鉴定杂种细胞的筛选仅提供了细胞杂种真实性的间 接证据。由于初始融合产物的遗传物质可能被排除，或在培养过程中会发生体细胞克隆变异等现象，因而还必须对获得的杂种进行严格的鉴定。用来鉴定体细胞杂种的方法除形态学(花的颜色、形态、叶子的形态和大小等)比较，细胞学观察(染色体、叶绿体数目、形态等)和生化分析(同工酶和次生代谢产物等)最直接的杂种证据来自于分子生物学鉴外，定。目前，用于体细胞杂种鉴定的分子生物学方法

以在 P R反应中介导 D A呈几何级数扩增。实 C N际操作中，每个 1聚体寡核昔酸引物， 0通常可产生几个(.1) ( 0不连续的 D A产物。这些产物是由 3 N不同的遗传位点产生的。多态性的产生是由突变或重排造成的。R P通常作为显性标记，然 AD虽 R P A D不能鉴定杂合子，重复性较差，但是用 R P AD检测容易、非专业人员也能操作、又易于实现自动化，所以在体细胞杂种鉴定应用中较广泛。徐子勤

有 R L,A D Suhr杂交、 F P R P,ote n原位杂交等。 51 F P和 R P . L R A D应用于鉴定体细胞杂种D A的限制性片段长度多态性 ( F P是由 N RL)于核酸序列不同而造成 D A限制性片段之间产生 N等位基因差异的结果，具有种的特异性和遗传稳定

等[〕 R P 1应用 A D分析紫花首猎与红豆草属间体细 9胞杂种，发现杂种细胞从双亲获得的遗传信息不等，杂种细胞的核遗传信息较多的来自于首借。金红等，〕‘应用 R P A D进行杂种鉴定的研究中也有类似的发现。

性，是一种非常丰富的遗传标记。它能直接发现同

源染色体上核昔酸碱基序列的差异， R L且 F P数量多，受环境和遗传背景影响小，在发育过程中稳定，通常以简单的孟德尔式遗传。等位基因常是共显性的，是检测个体间、品种间、种间 D A水平上的等 N

52种特异重复 D A . N

位性变异最敏感的方法。目前已构建的 R L F P遗传图谱的基因较少，主要有番茄[,、[ 5玉米[、 55 4] 5马铃 5]

重复 D A的进化速度很快， N而且在不同植物间存在着高度的序列变异，用种特异的重复 D A

N序列作探针对酶解的基因组 D A进行 S uhr N o ten杂交是一种确定体细胞杂合体的核杂种性可靠的方法。压片印迹和斑点印迹都是用种特异序列来确定体细胞杂种核杂种性的方法，其中斑点印迹可使各个亲本基因组对体细胞杂种相对贡献量化。用种特异性的探针与杂种的染色体涂片进行原位杂交，还可以鉴定出亲本的染色体、染色体片段以及易位。但是这两种方法都必须找到种特异性重复序列，而种特异性重复序列的分离，也较为复杂、费时。所以目前运用较多的是基因组原位杂交技术。 53 ote杂交在体细胞杂交中的运用 . Su r hn

薯[和某些油菜[等， 5 4〕 5所以用 R L 6] F P鉴定的体细胞杂种主要是番茄属(yo in L prc ) c e o和茄属(o - s Sl anm, u )以及芸苔属( rs c) B s a的一些种间和属间体 ai细胞杂种[.。另外， 55 4] 7由于植物基因组 D A较大， N RL F P片段在一块胶板上难以完全分开，所以常利用外源基因作探针， R L将 F P转移到尼龙膜上进行 Su e杂交。如 Wii s 5通过遗传作图， ot r hn l m等[ l a 8]选用连锁群特异的 R L F P标记，区分出了 S ln m oau

bv e与Stes r in ed s . ru u o m的种内杂种的染色体。 b近几年来又发展了P RR L C - F P法，即先采用广谱引物对亲本和杂交种进行 P R, C然后再用限制性内切酶酶切。Bra等[用部分基因组 D A进行 ods 5 9[ N RL F P分析，他们首先利用引物 I S, 4 T 1 I S对亲本 T和拟杂交种的基因组 D A的 1^2 s A进行 N 8 -5 D rN P R扩增， C然后用 S u a 3 A对 P R产物进行酶切， C

Su e b tn探针的标记， ltg ot r o i h n以前多用的是3同位素标记， 2 p由于同位素放射对人体造成伤害，后来发展了荧光标记法和地高辛标记法。杂交所需的探针有 R L F P片段，种特异性重复序列，目前运用较多的是外源标记基因(尤其是不对称杂种中供

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2 7卷

体所携带的基因) 1s N或 8 r A基因。在不对称体 R细胞杂交检测中，以供体总 D NA为探针，体受 D A为封阻进行 S uhr杂交可成功地鉴定不对 N oten称杂种[]由于不受探针的限制， 6, 2简便易行，ot- S uh

可以在不同物种间产生可区分的特异杂

交位点带型，以便将不同物种通过 CS区分开来或用于检 IH测外源染色质的存在。

CS IH分析所用的另一种探针是被打断的外源供体总基因组 D A, N同时用受体总基因组 D A作 N

e b tn是体细胞杂交鉴定中普遍使用的方法。 r ltg n i o Mi km等[采用 Su e z ai 6 u 3〕 ot r h n杂交手段检测了

封阻，这种方法称作基因组原位杂交(eo iis gnmc i n -

M dc o o ei g rgs a u a和M. ea体细胞杂种， s tla c lt u确认了其杂种真实性。近几年来多采用线粒体或叶绿

t hbdao, ) IH技术更直接简便， o ritnGS o y izi IH GS可与整条染色体杂交，而且杂交位点可以在细胞分裂任何时期观察到，所以在体细胞杂种鉴定中已经成为鉴定供体染色体及染色体片段最为有效而直观的方法。近来又发展了多色荧光原位杂交 ( Mc

体基因作为探针，对总 D A进行 Suhr N ote n杂交。 Moi ci 6采用地高辛标记， re rN r uh等[」 g 4对 i的 DA c和线粒体 D A标记， N鉴定了假定杂种胞核杂种的真实性。20年 V rt等[〕 01 a t 1将菊首和向日葵及 oo 8其拥有 1条染色体的拟杂种再生植株的总 D A 8 N用Bm工 a H酶切后，再用线粒体的 C x oI基因作探针，菊芭产生 22和 30 2 . k b . b k个特征片段，胞质不育系向日葵产生 33 71 2 . b和 .个特征片段， k k b而3个再生植株中的 2个拥有双亲特征带， 1另个除双亲特征带外，还产生了 1条新带，说明双亲的线粒体发生了重组。但无论 C x oI还是 C x oI都不能

GS ) IH技术，鉴别具有 A B C基因组的水稻体细胞，,杂种。利用 3种不同的荧光信号，每个基因组在杂种核中的分布及染色体间的易位和插入可被清楚地

识别[。我国体细胞杂交专家夏光敏多次运用[ 6 s 1GS IH进行杂种鉴定。如 20她应用 G S 06年 IH/

FS IH染色体组型分析技术将一抗旱基因定位在小麦与茅草杂交新品种 Sarn N . 5 hnog 3 A染色体 o的55其它方法 .

作为胞质不育的特征带，所以又采用 Hid nI I I酶切总 D A,R 52 N O F 2基因作探针，发现 3株拟杂种和胞质不育向日葵一样均存在 O F 2基因， R 52故该基因可

的臂E短上

6 7 1

SR s p s ec r a也被有效地应用 e une e ) S (m l e i q e t p于体细胞杂种的分析，通过进一步发展可鉴定染色体上特殊的位点，已用于育种中的分子标记辅助选

以胞质不育的作为特征基因。 03 ct〔 2年S t等6 0 oi 5 1利用 rl rs4 D A基因作探针对 Sl- p5和 p1 m N t o a

nm e s u t ru u o m和Sc mr n的融合杂种进行 b . eoi o si m鉴定，发现 rl和 rs4 p5 pl基因位点是线粒体基因重组较多的位点。 54基因组原位杂交在植物杂种中的鉴定 .

择[近年来运用较多的是核糖体 D A N ) 6 a[ N (D A r间隔序列分析( 5 rN如 s A间隔序列[ D 2 1勺及内部转录间隔区( S分析[ 0 rN ( 5 rN I ) T e 5 D A即 s A基 s s[ R因)属于简单多基因家族，在至今研究的所有真核生物中是一串联重复单位组成，与卫星 D A类似， N

染色体原位杂交技术( r o m *su c o s e。i b- hm o t ybiz i, H近年已经广泛应用于植物遗传育 r it nCS ) d ao I种实践，在植物体细胞杂种遗传鉴定方面也显示出其优势。CS是根据核酸分子碱基互补配对原 IH则，首先获得染色体 D NA制片，然后将染色体制片 D A和经过放射性或非放射性标记的外源核酸即 N探针变性为单链，二者复性，成为杂合双链核酸，再通过放射自显影、激发荧光等手段将外源核酸在染色体上的位置快速、直观、准确地显示出来。随着组

10 2b y的编码区表现出很高程度的序列保守性，非编码区由于未受到基因本身同样严酷的选择压力，

因而变异较大，随不同生物种类而长度不同。高等植物的间隔序列长度在 9^40之间， 0- b 0 y同一属的不同种植物之间以及同一种植物之间间隔序列的碱基序列和长度均不同。因此以保守的 5 r N s A编 D码区的一致序列为基础设计 P R引物， C用来扩增变异较大的非编码区，区别融合双方的核基因，以鉴定体细胞杂种。

织化学和分子生物学的发展， IH技术不断改进 CS和完善，在方法上放射性同位素标记已逐渐被分辨率高、安全的非放射性标记所取代，如生物素、荧光素、地高辛等。CS IH技术的探针来源较广，任何分离、克隆或合成的核酸都可作为探针。目前在植物 CS IH中一般都是用高度重复的串联或散布的

D A序列。这些序列有一些是物种专化的， N有一些

对mD A和cD A的鉴定， tN pN主要通过直接分离出 cD A和 mt N pN D A可进行 R L, - F P F P P RR L C分析或进一步用种特异基因序列作探针，行进

Su e杂交分析[。或者用叶绿体及线粒体特 ot r hn 7 0 1异重复序列探针或非特异重复序列探针对杂种总基

因组进行 R L F P分析[和 Suhr杂交分析。此 7 1 ote] n外，还可以通过纯化的 cD A", N[获得 p N l m D A7} t 1〕

植物体细胞杂交及其杂种鉴定方法研究进展

1期

张改娜，植物体细胞杂交及其杂种鉴定方法研究进展等：

2 1 1

的限制性图谱分析鉴定叶绿体和线粒体。

6植物体细胞杂交的应用、存在问题和发展前景虽然目前体细胞杂交还没有有效的手段将野生 资源中有益性状转移到栽培种中，仍然存在体细胞杂种再生困难或再生植株寿命短等问题。但是随着植物体细胞杂交的技术的不断完善，获得杂种再生完整植株的科属范围不断扩大，植物体细胞杂交技术将被广泛运用。( ) 1在育种方面的应用。传统的突变育种和有性杂交育种历时长，同时突变育种随

机性大，而采用融合育种将会缩短育种时间。尤其对于双亲花期不遇、雄不育或者某种作物基因库雌/已经通过杂交育种被充分利用，那么为了适应现代农业的高品质、高抗逆性的要求，就必需开发新的基因资源，进行远缘杂交。而融合育种可以克服远缘杂交存在有性不亲合现象；2应用于定向转移胞质 ()基因控制性状及核质互作的研究， C,如 MS以及利用配子一体细胞杂交产生三倍体植物等；3应用于 ()染色体定位或者进行染色体排除等机理研究。由于亲缘关系较远的物种进行融合后，会出现染色体排斥现象，这为此类研究等提供了便利条件。

参考文献：厂 L

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Z L E A, V G L N It sef t nf o ct l mc ls ri b fs n w e po p s o nr a N c i a E C R A I D A U E ne pci r s r y p s im e i y ui bten t l t f m l oa V, . r ic e f o a a a t l y o e e t r o a s o itn sl e r ad a iaie pool to m ls re t au[]Z P l znhs l 989:9一47 ye s i n Xr r d t r p s f e t i N a cm J. fa epyi, 7,0

37 0. v ts - y a d t a s a- el . r b . n o1「日

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S L I R ea. l g iac o sm t h bi o tm t ad aoJ. l eg sC m u. 7,417 3. MILE W t C in rs t e o ai yr s o a n p tt[]C r br R . m n,994:2一12 l hl e s n f c d f o o i as e o 1「| J

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gnr i o bcc s poei[]T e . l ee,959: 17 12 ee tn akr s gn sJ. o A p. t 19,11一1 . ao f o r e h r p Gn . 6 7厂

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s i p n tse tr[ . l e A ae iP bse, deh,9933 1. i n t u cl e M口Ku r dmc lhr D rr t19:6一48 s l i a s uu s w c ui s o c厂 L

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H AGI ORIM, M MA S M, T UZ K T,t Po ut n smaih bis w e Ni t n bnh min ad tbcm T UI MA S A I ea . d c o o o t y r bt en c i a ta a a N. u l r i f c d e oa e n aa

te rs t c o i[]Pat .19,123 2. t ah sJ. n Si,939:1一22 hi eia e p d r s n l c[0 K F R, LME I S A D N E T T Moi ai s f rl e p et t ac i ue b fs n pool t o 1] O E W G I LU K N B N T H . d i t n o l a dvl m n i o co cd ui o rtp s f . O f o f c o e o n b n d y o f a s

d f et l t i ctvr]T erA p. e 19,99一12 s re t asJ. o. lG nt,907:7 0. ie n m e e l u i仁 h fr a- p e .[1 K F R, LME I S A D N E T F s n m l s

re ac cue m d i t n o m D A d g cags 11 O E W G I LU K N B N T H T ui o a t i tbco ss ic i s t N l i t hn e i O . o f e l o e a o f a o f e n o a n

fr m r o g ad o tn e iy yr l t J P yio a n rm, 28: 4 3. y r t ao o ft t icbip n[ . sl iPat u 19. 3一38 l a op l n e r i f l n d s] h o g l a o l h o s ri a 9 53[2 L X ( 1] I李雪梅)WA G F王六发)IU X刘承宪)Eet fs n tbc clpool t e ky hi e o sei cl M, N L (,I C . ( . r ui o oac e rtp s udr t n us pc l l o o f o l c a n e e q c f a e l

e e o s n rud ok i tnJ. i oi z e m n l ic( gonw r i tui[]A tBo ga E pr et iSn a实验生物学报)19, ()17 6( C i s) lt f i o e r u o f nto s c a l e i a s i,973 2:5一14 h ee. 0 i n n[3 ME L W, a. c o m c gait n e c oui o p n clpo p s仁口Pat s l,998: 12 17 1] H E e lEf t f r r t i o l t fs n l t rt l t J. l P yi .18,91一1 . R t f s io v ao n r o f e e e a l o a s n h o 7 7[4 A A I S K MO O, E IH T ea. s ut n re r p nsJ. . eeaG nt,99253:0一56 1] K G H,A A T M N G S I t C nt co o i cbi l t]Mo G nrl e. 8,1 ()51 0., l o r i f y d[ c a l e 1[5 S A G N E G, L E M, N Z, lA y m tc ai hbizt n ten l ce( e ua niae 1] P N E B R G V L S P WA G Y ea. m er sm t yr i i b w e t f u F s c audnca A t s i o c d ao e a e l s t r She. ad i e t i

rers (oi ui o m . pool t J. ho. p l nt 19,859 1. r d t I ln gas l mm t l u L m ) rtp s[口T erA p. ee,948:0一59 cr ) n ia a d a y b r a L u fr a as G .仁6 Y W, I G,H D,t T as r sltl ac f m e uou lt ai s es t w et T icm svm )v 1口 UE X A M Z I ea. nf o a o rne A l rp s o l i ni o a ( r i a t u I i Y l r e f e t r o e i r s t n s h tu e i . a ay m tc t yr i i[]Pat . 0,6:5一26 aih bizt nJ. n Si,011129 6. sm e ism c d a o r o l c 2[7 G O P A A D,H N YJea. gt cbizt n crst nf o st m ctp s t sey t as pt - 1] U W W,R S D C E G t T re d r i i i iu: as r a u a ol m ed clvr f oe, l a e y d ao n t r e f s y a o ui o r n tl d s e[]Pat l . 0,2 1) 2 5. sJ. n ClR p,042 (0:5一78 i sel s s a e en l e e 2 7[8 V R T O N N E L C H N, a. dco oay m tc ac r p ns w e Ccoim yu L ad l n 1] A O T S E Z U C I M e lPout n sm e ism t hbi l tbt en hr itbs n H i -,, t r i f r o i y d a e i u n . e a

t s us J. o. . t 20,0:5一96 []T er p l ee,011290 5. h anu L u n . h A p Gn .

[9 U Q徐子勤)J J 1] Z X (, A ( I F贾敬芬)M lu r titn n r nr s ac r p n bte aaa sn i J. - . o cl i nfao o ie eec t hbi l t e e ll ad fn]C i e a d i i f g i o i y d s w n f n a o[ h e c t m a f ins Jun l B t h o g ( f o cnl y

生物Y程学报)20,62:7 - 7i C i s) e ora o i e e o,001 ()1 3 7 ( h ee. 1 n n

植物体细胞杂交及其杂种鉴定方法研究进展

21 2

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2 7卷

X0 G V I E K T, H E 2] A R L N O T IME R K A M. oee e l i o L c ei n uetm ( R O K V C t nt aa s f o r o e l u+)S l u e brsm m t b -, y g i n y s y p c s n c o nm ueou s a c a t o i y

bi ad i nr nt r nr t J. o. l e t 0,0:3一29 adoeec ee ns]T erA p. e,011321 3. r s t r g i e d n h e g a仁 h p Gn .2[1 2] N MQ,I G P N Z . h - l ac wt i r r s n r f m tn B perm roe fl m l. . WA G XA M,E G Hg U te ne h o e i hbi o ao o u l u s znr o u Wi[] Y i V or i n g so y d i f u t r c o i i l J dP a t . 0,6:9一6 0 18 5 3 0 . ln S i,0 5 c 2

[2 Y N G N T,U A R E WA A A E, a. dc o ad rc r ao o a i e pcih bi bt en k gr 2] A A I O S G WA A, T N B M e lPout n caat i t n n r eic r e e l ad - t r i n h e z i f n s f y d w t e n a e

t仁]T erA p. t 20,0 ()1 . p l ee, 3 7 1:一5 i J. o. G n . 1 c h 0

[3 R WE E A N E S, L J t o ac ritn w e te a u u t T l pc rlc s Bas 2] E R, D R J N E, a. t hbiz i bte h z c m lo h si u sn ad s- B PS U AA G Se lSm i y dao e n i c n c a r a a e e n r i e cnp s口T o A p. nt 19, 7一71 e, p l ee,999: 1 7 a u[ . h r a J G . 96[4 P N LU U C S tlP n r ee tn m spy p t ltote pa m d i l

tA t ia a 2习 A Z,I CZM R H, a. t nr i f m ohl r o a s h E ytn in p ns e s jdi G, Je l e ao r e a g o l p s f g i e c a l o a rm i u -c L ad i s n ii s c[]Pat . 0,6:8一67 np si s s u T r . . n Si,031561 8. a n Eh o p o sm . c uzJ l c 2[5 ZMN C - UZ WS A, E E K R, R S C U A,t lR s tne p yo hh r i et s smai h bis S ln m 2] I O H G O K E L B C A K Y Z Z K ea. i ac t h tp toa s n i o t y r o o u es o n a n f c d f a刀 gr m Z u

I ad ld t oJ. o. l ee, 317:3 8 .n d o p a仁] T erA p. t 20,0 0)4一4. i i ot p h p G n . 0D X A ,HA SY,t T o vl S I G M Z O ea . n e HMW b nt b nf i t w et ei i a bi l e w e T as v m d, l w o s u i ee c l ha bed g h r i bt en e iu a u s ia o r n n y d e n, t n

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A e nau[ . o, l e t 20,1()16 4. ]T erA p. e,05101:3一14 . gt J h l o m p Gn .

仁7 XA G F N BXA M, a. oo it iad tn pnn o F hbioint f m e eec ac r- 2] IN FL E G I G e lA r mc t p e cm oet 2 r ri e r i r nr s t hbi ,, t gn r n r io a o f y d a d n g i o i y d g o t mi tn w e ri at m A o r l gt J. o n a i ( Ticm iu ad r yo e na m[]A tB t i Sn a植物学报)20,33:3一27 z i bten tu sv n g p n ao e o u c a a c i c,014()22 3[8 S A L单雷)Z A S Y赵双宜)Q A T权太勇)ea. ao ad l io c N f g et r pne t sl z] H

N (,H O ( H, U N Y (,t I li n aa s f A m ns odd a- l s t n n y s D o r a e s o t

se f m e o t hbi i bten tu ei a A o r l gt b ie nad p yJ. ih h l y s ac r le w e Tic asvm d r yoe na m df etl l[习H g Tc o g t s r a w i y d e r s n o m n ri m t u n g p n u y r i i a o f s enoL t r( e es高技术通讯)20,7:9 3 C i s) t,04 ()2一3 ( h ee. i n n

[9 C E S I GM,U N Yea. i o t sto r c oF一F hbd s i t f m ac ritn 2] H N, A Q A T tl t e n a- la e 3 s r leog a d s t hbdao b- Y X, S d s h lte n f u e y i i r n e r o i y iz i e n i o mten m n a ad n yu p tu J. nSi,041773 7. w et T i p rm ni m[]Pat . 0,6:7一79 w e cm o h n h o o o c l c 2

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仁4 XA 夏光敏)XA G (凤宁)Frlp n r ee t f m e eec ac ritn w e Tic a t u 3] I GM(,IN F向 N . i l t e nr e r i r nr s t hbiz i bte ri m i m e e s a d n g i o i y d ao e n tu e v t a g o t m s

L ad rp rn nau ( s ) . a tnc Snc ( . A oyo e gtm t[]A t B a i ii植物学报)19,14:4- 2i C i s) n g l o Ho . c o a a J,994()39 5( h ee. 3 n n[5 S N A, . co o cl ui o p n p t l t e c i l u tnJ. nClP yi . 7,0 1一1 3] E D M ea Id tn e fs n l t o a b l tc sm l i仁]Pat l s l,992: 41 43 t nu i f l l o f a r p s y ra t ao o e i l e h o 1 4 4[6 ZMME MA N,C E RC P Hg f qec f i o p n po p s b e c i l sJ. n,91112

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e na m ot) ei i]T erA p. e, 0, 729 0. l gt ( s N v h J. o. l e t 2 31:9一35 o u H . s[ h p Gn . 0 0K S K H, L, IA A ea. d co ad a s o ay me ih bi p ns w e m nctl o ( rz .t a IA A L E H K S K M, lPout n a l i f m tc r l t bt en ooy dn ya i E t r i n n y s s r y d a e o e O s v a

L ) n d o l o ( acs t L ) T e . p l ee, 9,935 7. . ad te n uucr a[] ho A p. t 1 48:6一31 i yd D c ao . . r J Gn . 9A O S CI H R I K, H MA -O T N ea. co o sm t h bi p ns N ct n truh oecne F N O A K N R T A SC MP O M A, lSl t n o ac r l t i i i a og f rsec, t e i f i y d e a n o a h l u -

植物体细胞杂交及其杂种鉴定方法研究进展

1期

张改娜，:物体细胞杂交及其杂种鉴定方法研究进展等植

a i t srn o p t lt J. e nl y18,: 1 cv e otg r o a s]Bo c o g, 38 . ta d i f p s[ i h o 95 1 o t仁 9 G L R I H W, U H JIeti t n fs n p n pool t I C n i n f te rd c lf oecne en o 4咋 A B A T D MA C T dnic i o ui o l t tp s . od o s h rpoui e r ec l l g . fao f o f a r as . t o r e b l s u a i f b

po p s dr e f m spy tseJ. faznhs l18,819 4. r ol t evd m ohl iu[]Z P l epyi,909:2一10 t a s i r o e l s . n o[ 0 G E A It gnr ay m tc bi bt en ct n pu bgnf l ad rp bl dna ti d gm a i 5] L B Y Y ne eei sm e i h r s w e Ni i a m a i ol n A o a l on o a e b a m fs n . r c r y d e oa l i a t ea b n y uo

仁]T erA p. e,987:6一

76 J. o. l e t 18,670 6. h p Gn .S MO L V ,I K T e e i ai i ds ad A net sm t h bi cl i poui ay m tc ns A Y O V M SN K C h rlo r d t n e D . o f a o o n N c t o o a c r ai rd c g m e ip t b- r o n f i y d l n n s r l a e尸1匕

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,「|〕列

ten i e pcit a hbiad p n[]T e . p l ee,969:5一87 w e a n r ei o t yr n egl t . o A p. nt 19,280 5. n s f m o d g a J h r t c G . C E FG陈凡国)XA ( H N (,I GM夏光敏)Z A G Y张学勇)Suy ay m tc ac r itn w e cm o w et,H N X ( . d o sm e ism t hbiz i bten m n a t n r o i y d ao e o h ( r i m svm) m i (e m y) . a tB r l-cietSn( T ic a t u ad z Za s[]A tB . e . c n. .西北植物学报)20,11:2一81 C i s) tu e i n a e a J c o oa O d i,012()86 3 ( h ee. i n nJ

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