大鼠萎缩性胃炎癌前病变差异基因表达谱研究

目的 应用表达谱基因芯片技术筛选大鼠慢性萎缩性胃炎(Chronic Atrophic Gastritis,CAG)癌前病变的差异表达基因, 从基因水平探讨CAG癌前病变的发生机制。方法 应用大鼠基因表达谱cDNA芯片, 检测CAG癌前病变大鼠胃粘膜和正常大鼠胃粘膜中基因的差异表达变化, 筛选出差异表

大鼠萎缩性胃炎癌前病变差异基因表达谱研究1

李军祥1，张玉禄1，朱陵群2

1．北京中医药大学东方医院消化内科，北京（100078） 2．北京中医药大学中医内科学教育部重点实验室，北京 (100700)

E-mail：lijx970508@http://www.77cn.com.cn

摘 要：目的 应用表达谱基因芯片技术筛选大鼠慢性萎缩性胃炎（Chronic Atrophic Gastritis，CAG）癌前病变的差异表达基因， 从基因水平探讨CAG癌前病变的发生机制。方法 应用大鼠基因表达谱cDNA芯片， 检测CAG癌前病变大鼠胃粘膜和正常大鼠胃粘膜中基因的差异表达变化， 筛选出差异表达基因，建立与CAG癌前病变形成相关的基因表达谱并进行生物信息学分析。结果：与正常大鼠胃粘膜比较， CAG癌前病变大鼠胃粘膜发生显著性差异表达变化的基因有300个， 其中上调 227 个、下调 73 个， 涉及到多种生物学过程及信号传递调控基因的改变。结论 CAG癌前病变是一个复杂的病理生理过程， 受多种基因调控；差异表达基因谱的建立和研究较全面反映了CAG癌前病变发生的分子生物学概貌， 有助于认识CAG癌前病变形成的机制，为进一步寻找特异性诊断和治疗基因提供了有力的实验依据。

关键词：基因表达；基因芯片；萎缩性胃炎；癌前病变；大鼠

慢性萎缩性胃炎（Chronic Atrophic Gastritis，CAG）是消化系统常见病、疑难病之一，在CAG基础上伴发的肠上皮化生（Intestinal Metaplasia ，IM）和异型增生（Dysplasia ，Dys）是胃癌前期病变[1]。经过长期、大量的研究，CAG癌前病变发病机制仍不十分清楚， 寻找CAG癌前病变形成过程中相关目的基因，可从基因水平进一步研究大鼠CAG癌前病变发病机制。本实验应用大鼠基因表达谱cDNA芯片， 检测CAG癌前病变大鼠胃粘膜差异基因表达变化， 筛选出差异表达基因，建立与CAG癌前病变形成相关的基因表达谱并进行生物信息学分析，可较全面反映CAG癌前病变形成过程中的相关基因表达谱， 为进一步分析筛选出特异性的诊断和治疗相关基因提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

雄性Wister大鼠，体重180～220g，清洁级，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。实验动物许可证编号：SCXX（京）2002-0003。大鼠在相同条件下分笼饲养，每笼5只，常规喂养标准颗粒饲料，自由饮用水。

1.2 动物实验技术条件

北京中医药大学东直门医院中药药理学实验室II级动物实验室，许可证号：SYXK 11-00-0029。

1.3 主要仪器

1.3.1 微量天平，HANGPING JA1003，上海天平仪器厂。 1.3.2 Agilent 2100 Bioanalyzer：Agilent(型号：G2938B) 1

本课题得到教育部新世纪优秀人才支持计划（NCET-05-0140）的资助。

目的 应用表达谱基因芯片技术筛选大鼠慢性萎缩性胃炎(Chronic Atrophic Gastritis,CAG)癌前病变的差异表达基因, 从基因水平探讨CAG癌前病变的发生机制。方法 应用大鼠基因表达谱cDNA芯片, 检测CAG癌前病变大鼠胃粘膜和正常大鼠胃粘膜中基因的差异表达变化, 筛选出差异表

1.3.3 Nano Drop Spectrophotometer：型号：ND-1000 1.3.4 酶标仪:型号:KC4

1.3.5 MJ PCR仪：型号:PTC-100 1.3.6 UVP杂交炉：型号:HB-1000 1.3.7 Agilent扫描仪：型号:G2655AA

1.4 大鼠CAG癌前期病变模型的建立

按赵凤志等[2]的方法，将雄性Wistar大鼠(体重230～260g)禁食不禁水16小时后，以1.0％戊巴比妥腹腔注射麻醉(0.5ml／100g)，称重，固定大鼠四肢，在无菌条件下开腹，暴露胃，在胃前壁距幽门环0.2cm无或少血管处切一小口，将一长约2cm，直径约0.2～0.3cm的金属弹簧前1/3插过其幽门环进入十二指肠，用缝线将弹簧两端及中央固定，按手术常规逐层缝合胃及腹壁切口。手术后禁食不禁水24h，恢复性饲养1周后，开始每周每只大鼠灌胃60～70℃高盐热淀粉糊2次(含15％氯化钠)，每次2ml，连续24周。并于造模结束前随机抽取模型组大鼠8只进行胃粘膜病变理形态学检查，其中7只出现轻～中度不典型增生，确认造模成功。

1.4组织取材

造模第24周，光镜病理切片证实动物模型复制成功后，采用乙醚麻醉法，剖腹取胃，CAG癌前病变组（模型组）在胃窦部阳性病变部位取材，空白对照组在胃窦部取材，各1例，取材后标本迅速液氮冻存备用。

1.5大鼠表达谱芯片

大鼠12K基因表达谱cDNA芯片， 覆盖11060种基因，其中Unigene 10695条，已知基因5657条，EST4716条。

1.6探针制备

1.6.1按照TRIzol试剂说明，采用异硫氰酸胍一步法抽提所取胃粘膜组织总RNA，所提总RNA经琼脂糖凝胶电泳确定其完整性。

1.6.2 用 Oligotex mRNA Midi Kit(Qiagen 公司)纯化 mRNA。每一份探针取4µg mRNA，逆转录标记 cDNA 探针并纯化探针。模型组来源的mRNA 由 Cy3-dUTP标记制成探针，空白对照组来源的 Cy5-dUTPmRNA由 标记制成探针。

1.7芯片杂交(cDNA芯片杂交)

1.7.1 取出经定量的Cy3和Cy5标记的探针，取Cy3探针90 pmol，Cy5探针60 pmol，浓缩至7ul,然后转至0.2 ml PCR管内。

1.7.2 将溶解的探针置于PCR仪中94℃ 变性3 分钟左右，取出加 …… 此处隐藏：8922字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……