RNA甲醛琼脂糖凝胶电泳的优化及探讨

现代生物医学进展http://www.77cn.com.cnProgressinModernBiomedicineVol.11NO.2JAN.2011

·351·

·技术与方法·

RNA甲醛琼脂糖凝胶电泳的优化及探讨*

张小林1韩丽君2李龙2林志雄1△

2厦门大学医学院药学系福建厦门361005（1福建医科大学附属第一医院神经外科福建福州350005；）

摘要目的：优化RNA甲醛琼脂糖凝胶电泳条件。方法：对实验器材进行彻底的RNase灭活处理;在原有电泳过程的基础上,增加预电泳、缓冲液液面的处理和制胶过程中未加入溴化乙锭等优化过程。结果：优化后的电泳不仅能验证总RNA的完整性,而且能鉴定RNA的分子大小。结论：优化的RNA甲醛琼脂糖凝胶电泳法操作简单、省时、快速,RNA条带清晰、定位准确、无弥散及非特异条带。

RNA；RNase；关键词：电泳；琼脂糖R446中图分类号：

A文章编号：1673-627302-351-03文献标识码：（2011）

TheOpitimizationandDiscussionofRNAFormaldehydeAgarose

GelElectrophoresis*

ZHANGXiao-lin1,HANLi-jun2,LILong2,LINZhi-xiong1△

(1DepartmentofNeurosurgery,TheFirstAffiliatedHospitalofFujianMedicalUniversity,FujianFuzhou350005,China;

2DepartmentofPharmacology,theSchoolofMedicine,XiamenUniversity,FujianXiamen361005,China)

ABSTRACTObjective:ToopitimizetheconditionsoftheRNAformaldehydeagarosegelelectrophoresis.Methods:Thoroughlyin-activateRNaseofexperimentalequipments;Basedontheoriginalelectrophoresisprocess,addingtheopitimizedprocedures,suchas:pre-electrophoresis,treatmentofbuffersurfaceanddecreasingethidiumbromideintogeletc.Results:TheopitimizedRNAelectrophoresisnotonlyverifytheintegrityoftotalRNA,butalsoidentifythemolecularsizeofRNA.Conclusion:TheopitimizedRNAelectrophoresisissimple,time-saving,fastandRNAbandsareclear,accurateposition,nodispersionandnon-specificbands.

Keywords:RNA;RNase;electrophoresis;agarose

ChineseLibraryClassification(CLC):R446Documentcode:AArticleID:1673-6273(2011)02-351-03

前言

cRNA探针的原位杂交、Real-Time构建cDNA文库、

PCR、Northern-Blot和Dot-Blot杂交分析等分子生物学实验，都需要纯度高、完整性好的RNA。RNA甲醛琼脂糖凝胶电泳是常用的分离RNA、鉴定RNA大小及完整性的电泳方法。本文拟就RNA甲醛琼脂糖凝胶电泳的条件优化进行综述并初步探讨。

agrose(Amresco),其余试剂均为国产分析纯。1.3仪器

DU800核酸蛋白分析仪(美国贝克曼库尔特公司),DYY-2C稳压稳流型电泳仪(北京六一仪器厂),DYCP-31DN型,JS-680B全自动凝胶成琼脂糖水平电泳仪(北京六一仪器厂）像分析仪(上海培清科技公司)。1.4Trizol法提取总RNA

细胞和组织的总RNA的提取过程按照Trizol试剂说明书推荐的步骤操作。对提取的RNA在DU800核酸蛋白分析仪上测A260值和A260/A280值，确定所提取总RNA的浓度和纯度,A260/A280比值在1.8-2.0为纯的RNA[1]。1.5烧瓶、烧杯、药匙、量筒的处理

烧瓶、烧杯、药匙和量筒用去污剂清洗后,去离子水冲洗干净，放入未灭活的1‰DEPC水中浸泡过夜,然后取出上述实验器材,高压消毒灭活DEPC,烘干备用。1.6电泳槽和制胶器的处理

1材料与方法

1.1材料

小鼠肝脏组织和脂肪组织,C6细胞和SHG44细胞(中科院上海细胞所),cRNA探针(美国加州大学欧文分校馈赠)。1.2试剂

10xMOPS缓冲液(Solarbio),DEPC(Solarbio),Trizol(Invitro-gen),RNALadder(Fermentas),2XRNALoadingDye(Fermentas),

*基金项目：国家自然科学基金资助（30973083）

作者简介：张小林(1983-),男,硕士研究生,研究方向:脑肿瘤的基础研究与临床治疗;电话:0592-2187210E-mail:syzxlin@http://www.77cn.com.cn

△通讯作者：E-mail:Lzx1967@http://www.77cn.com.cn林志雄,男,博士,教授,硕士生导师,研究方向:脑肿瘤的基础研究与临床治疗；(收稿日期：2010-10-21接受日期：2010-11-19)

·352·

现代生物医学进展http://www.77cn.com.cnProgressinModernBiomedicineVol.11NO.2JAN.2011

电泳槽及制胶器用去污剂清洗后，去离子水冲洗干净，放入3%的H2O2中浸泡10min，然后用灭活的1‰DEPC水冲洗干净，放入超净台中紫外线下照射过夜。1.7RNA的甲醛琼脂糖凝胶电泳

按照文献[2]报道的方法进行甲醛琼脂糖凝胶电泳,并在此基础上进行如下优化:①.预电泳10min;②.缓冲液的液面在预电泳之前是略低于胶面,而在sample及Ladder上样电泳5min③.制胶过程中未加入溴化乙锭。后是略高于液面；详细步骤如21.6ml高压消毒的下：①.配制1.5%甲醛琼脂糖凝胶30ml：

DEPC水与0.45g琼脂糖粉末混合后摇匀，微波炉中彻底熔化琼脂糖,然后加入3ml10xMOPS缓冲液并混匀。当琼脂糖溶液冷却至约60℃时.在通风橱中加入5.4ml新鲜的37%甲醛并充分混匀。②.插好梳子,缓慢灌胶,小心除去梳子周围及凝胶中的③.RNA样品的处理：4μl的气泡。待胶凝固后,小心拔出梳子。RNAsample或RNALadder与等体积的2XRNALoadingDye70℃加热10min，混匀，冰浴3min,凝胶上样前短暂离心。④.将胶放入电泳槽中,加入灭活的1‰DEPC水稀释的1xMOPS缓冲液,液面略低于胶面。⑤.100V预电泳10min。⑥.上样于胶槽中,100V电泳5min,让sample及Ladder进入凝胶后，再加入1xMOPS缓冲液,让液面略高于胶面。⑦.100V电泳约1h。然后在紫外灯下观察电泳结果,并在凝胶成像分析仪上拍照。

160、1900和4700个核苷酸[3]。小鼠肝和28S,分别具有约120、

脏和脂肪组织经1.5%的甲醛琼脂糖凝胶电泳后,显示出三条清晰明显的条带。对照RNALadder的分子量,这三个条带分别为:5S、18S和28SrRNA,且28SrRNA条带的亮度约为18SrRNA的两倍,说明RNA甲醛琼脂糖 …… 此处隐藏：4949字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……