免疫组织化学染色技术

免疫组织化学染色技术法医.

学

院

官大威

第一节常规组织学染色技术概述宏观微观超微结构基因水平组织形态学研究技术的种类：一、病理大体组织标本的染色方法在标本制作中，为了某种特殊目的，突出显示标本的重要部分，借助组织切片的特殊染色方法对标本进行染色，将病变器官及不同组织成分用染料染成不同的颜色，以便于区分大体标本的不同成分和病变特点，如：脂肪组织染色法目的：主要用于心、肝、肾脂肪变性，动脉粥样硬化大体标本的染色

试剂：苏丹Ⅲ或苏丹Ⅳ结果：病变处脂肪组织呈橙黄色早期心肌梗死染色法目的：显示早期心肌梗死的区域试剂：0.1% NBT(硝基四唑蓝)/ 0.2 mol/ L PBS (pH 7.6)方法：将2-3 mm厚新鲜心肌大片放入试剂中，37°C孵育20 min。结果：正常心肌呈蓝色，早期心肌梗死区、纤维结缔组织、瘢痕组织呈浅蓝色或不显色。注意：新鲜标本，尸检心肌不超过6小时。

二、光学显微镜下的组织学染色方法 常规HE染色(hematoxylin and eosin staining) 组织学特殊染色 1. Mallory三染色、Masson三染色 2.神经纤维的镀银染色 3.其他的特殊染色，包括钙、铁、铅、铜、黑色素和脂褐素、细胞DNA和 RNA的染色等上述的各种染色方法只能在细胞水平上显示组织结构的形态改变。

三、超微结构的观察 光线波长的限制，光学显微镜的分辨率极限为0.2μm有效放大倍数最高不超过2000倍。 电镜的分辨率最佳可达0.14nm,放大倍率最高可达100万倍。

第二节免疫组织化学染色技术Immunohistochemical technique由于该技术主要是用于研究和观察细胞中的某些结构或分子物质和组织细胞间的成分，因此现又称为免疫细胞化学技术。根据标记物的不同，免疫细胞化学技术可分为： 1.免疫荧光细胞化学技术 2.免疫酶细胞化学技术 3.免疫铁蛋白技术 4.免疫金-银细胞化学技术 5.免疫电子显微镜技术

一、免疫组织化学染色方法的原理 抗原(antigen)1.定义：是一类在适合条件下能激发机体免疫系统发生免疫应答，并能与免疫应答产生的效应物质 (抗体和效应细胞)在体内或体外发生特异性结合反应的物质。抗原具有两种性能： (1)免疫原性(immunogenicity)指抗原分子具有诱导机体产生免疫应答的特性。 (2)反应原性(reactogenicity)指抗原分子与抗体或效应 T细胞等免疫应答产物发生特异性反应的特性。

2.抗原的分类完全抗原、半抗原免疫学分类胸腺依赖抗原与非依赖抗原外源性抗原：微生物、花粉等内源性抗原：隐蔽的自身抗原、肿瘤相关抗原等同种异型抗原：人类白细胞抗原、血型

抗原异嗜性抗原：人与其他动物、植物等之间存在的共同抗原

临床分类

抗体(antibody)1.定义：机体受到抗原刺激后，通过体液免疫应答， B淋巴细胞活化、增殖，分化为浆细胞，由浆细胞合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋白，称为抗体。大部分抗体电泳后位于γ区带，1972年国际免疫学联合会正式将化学结构相同或相似的一类球蛋白分子统一命名为免疫球蛋白(immunoglobin,Ig)。 2.抗体的种类:五类，即IgA、IgD、IgE、IgG、IgM免疫组织化学染色技术中，使用的抗体主要是 IgG,个别情况下使用IgG的亚型，多为IgG1。

免疫组织化学染色的反应原理及显色原理1.免疫组织化学染色的反应原理染色反应的最基本原理是抗原抗体的反应。通过对针对标本中相应抗原的抗体上标记某种发色剂或酶类，再通过激发发色剂或使用某种显色剂，在显微镜下使标本中抗原抗体反应的部位产生肉眼可观察到的颜色以确定所要检测的抗原是否存在。通过免疫组织化学染色技术，在光学显微镜下即可检测到所要研究的蛋白分子类物质的存在与否。

2.免疫组织化学染色的显色原理(1)基本原理荧光标记或酶标抗体的染色分为直接法和间接法。其中以酶标抗体法应用最为广泛。n直接法：是将酶直接标记在第一抗体上，用酶标抗体与

切片上待检测的组织或细胞中抗原反应，再用底物显色，显示出所检测的目的抗原的部位。n间接法：是将酶标记在第二抗体上，检测组织或细胞内

的特异性抗原物质。间接法中所用的一抗是针对组织或细胞中某种抗原的特异性抗体，多数抗体是由家兔制备的多克隆抗体，单克隆抗体是由小鼠制备的。

第二抗体是第一抗体的抗体，所以只要不同的第一抗体均来自同一种属动物，同标记的第二抗体结合就能用来显示不同特异性抗原的存在。这样可避免直接法中标记每一种第一抗体的麻烦。通过某种技术增加第二抗体上标记酶的含量，可提高免疫组织化学染色的敏感度。 IHC技术中，绝大多数以间接法为常用。 (2)显色的基本程序 1抗孵育切片或细胞涂片 2抗(酶标抗体)孵育切片发色剂显色 (核复染)

(3)酶标抗体法的显色原理及显色剂辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP) HRP· H2O2 HRP+ H2O2 HRP· H2O2+ DH2 HRP+ D+ 2H2OHRP催化的酶促反应第一步是特异的，其余反应是非特异的，因此，可选用各种供氢体作为显色剂，可使反应的终产物呈现不同的颜色，如： CN(4-chloro-1-naphthol)为蓝色 TMB(tetramethyl- benzidine)为深蓝色 AEC(3-amino-9-ethyl-carbazole)为红色 DAB(3,3-diamino benzidine)为棕色

碱性

磷酸酶 (alkaline phosphatase, ALP)是以AS-Mx为底物，FB/FR (Fast blue/Fast red)为发色剂，生成蓝色/红色 …… 此处隐藏：1214字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……