慢性乙型肝炎患者炎症相关差异表达基因cDNA文库的构建和筛选

第27卷第1期2006年2月

同济大学学报(医学版)

JOURNALOFTONGJIUNIVERSITY(MEDICALSCIENCE)Vol.27No.1

　Feb.,2006

　　文章编号:1008-0392(2006)01-0004-05

慢性乙型肝炎患者炎症相关差异表达

基因cDNA文库的构建和筛选

唐翠兰,彭国平,陈　智,朱海红,郑　敏

(浙江大学医学院附属第一医院传染病研究所,杭州　310031)

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筛选慢性乙型肝炎(chronichepatitisB,CHB)(asymptomaticHBV摘要:目的　

carriers,ASCs)表达差异的基因。方法　分离CHB及ASCsbloodmononuclearcells,PBMC)并提取RNA,SMART技术合成cDNA,on,SSH)技术构

建差异表达基因cDNA文库,进一步采用dotblot经过筛选共获得了22个阳性克隆,通过序列分析,发现它们代表在,在ASCs表达增高的基因中,多为新基因。结论,对于阐明CHB关键词:慢性乙型肝炎;无症状乙型肝炎病毒携带者;抑制消减杂交

中图分类号:R512　　　　　　文献标识码:A　　在我国慢性乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)感染仍然是严重的健康问题,我国约有1亿无症状乙型肝炎病毒携带者(ASCs)和3千万慢性乙型肝炎(CHB)患者,慢性HBV携带代表了机体对HBV的耐受状态,而慢性乙型肝炎被认为是机体打破了对HBV的耐受

[1]

浙江大学附属第一医院住院或门诊患者,两组患者年龄及性别无差异,所有患者排除甲、丙、丁、戊型肝炎病毒感染,诊断均符合2000年西安修订的病毒性肝炎诊断标准。

α)对免疫的影响,所有为避免干扰素α(IFN2

α。患者均未使用过IFN2

1.1.2　主要试剂　PBMC分离液histopaque21077

。机体HBV的免疫反应是

由多种基因调控的复杂反应,因此,机体对HBV免疫反应的基因调节差异决定了不同的感染状态。目前关于机体在这两种感染状态下的基因表达差异未见报道,在本研究中,我们采用抑制消减杂交技术

(suppressiosubtractedhybridization,SSH)构建ASCs和CHB之间差异表达基因的cDNA文库,并通过dotblot进一步筛选差异基因。1　材料与方法1.1　材料

1.1.1　标本来源　外周静脉血采自6例CHB(2例

购自Sigma(SIGMA2ALDRICH,MO,USA),提取总

RNA的TRIzol试剂购自GibcoBRL公司(LifeTech2nologies,Gaithersburg,MD),SMARTPCRcDNASyn2thesisKit,PCR—Select

TM

cDNASubtractionKit购自

C1ontech公司(Clontech,PaloAlto,CA),pGEM—TEasyvector购自Promega公司(Promega,Madison,WI),DIGLabelingMixKit,Anti2DIG2AP,nylonmembrane(positivelycharged)及DIGnucleicaciddetectionKit购自Roche公司(RocheDiagnosticsGmbH,Mannheim,Germany),PCR引物由上海英骏

轻度,2例中度,2例重度)及6例ASCs患者,均为

收稿日期:2005-09-04

基金项目:浙江省科技厅重点资助项目(2003C13015)

作者简介:唐翠兰(1971-),女,主治医师,医学博士.E2mail:

tangcuilan165@http://www.77cn.com.cn3

通讯作者:陈　智,男,教授.E2mail:chenzhi@http://www.77cn.com.cn

α菌株由本室保存。公司合成,E.coliDH51.2　方法

1.2.1　PBMC的分离和总RNA抽提　每例患者取2～10ml外周静脉血,肝素钠抗凝,按照分离液his2topaque21077说明书分离PBMC,按TRIzol试剂盒操

作说明提取PBMC总RNA,通过紫外分光光度仪及

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　第1期唐翠兰　等:慢性乙型肝炎患者炎症相关差异表达基因cDNA文库的构建和筛选

凝胶电泳检测其纯度和质量。1.2.2　SMARTcDNA合成　为消除个体差异对杂交结果的影响,每组取6份RNA混和,取2μgRNA采用SMART技术合成cDNA,SMARTPCRcDNA合成试剂盒提供了合成全长cDNA的方法。合成过程参照试剂盒说明书进行,合成后的cDNA用限制性内切酶RsaⅠ酶切成小于2kb的片段以利于随后的杂交。

1.2.3　SSH　参照消减试剂盒PCR—SelectcD2NASubtractionKit说明书进行,在正向消减(C2A文

TM

TM

3730DNA测序系统测序,以T7为测序引物进行核

苷酸序列测定。而后,对各个克隆的序列进行载体

序列去除、重复及无义序列屏蔽等加工,对加工后的序列进行同源性分析,并对差异表达基因的生物学意义进行初步分析。2　结　果2.1　RNA的质量

库)中,以来源于CHB的cDNA为检测者(tester),

以ASCs的cDNA为参照者(driver),在反向消减(A2C文库)中,以ASCs的cDNA为tester,以CHB的cDNA为driver,TestercDNA分为两份,不同的接头,要求,再和过量的c2,然后通过2轮PCRcDNA。消减杂交完成后,通过比较G3PDH在消减前后的PCR产物的量来检验消减效率,如果消减效率较高,就可以进行消减文库的构建。1.2.4　消减文库的建立　将消减杂交后的第2轮PCR产物克隆入pGEM2TEasyvector,转化感受态

α菌,经过蓝白筛选,每个文库约有100E.coliDH5

～200个阳性克隆,随机挑选98个白色克隆(52个来自A2C文库,46个来自C2A文库),提取质粒后用PCR扩增鉴定插入片段大小。

1.2.5　消减文库的dotblot筛选　取两张相同大小

构建消减文库要求高质量的RNA,通过电泳可

看到两条清晰明亮的18S和28S核糖体RNA条带,并且28S的亮度在18S。RNA纯,A260/A280在1.8～2.02.dsDNA与接头连接效率的高低是构建消减文

库的重要环节,如果接头的连接效率低下,会导致部分信息的丢失,按要求接头连接的效率应大于25%。利用管家基因G3PDH的3′,5′特异性引物以及G3PDH的3′特异性引物与接头的外侧引物prim2er1对testercDNA进行检测,结果如图1,G3PDH的3′特异性引物与接头的外侧引物primer1组合的扩增条带,即连接上接头后的PCR产物(条带1,3)与G3PDH的扩增条带(条带2,4)的比值大于25%,说明大于25%的cDNA已连上接头

。

的带正电荷的尼龙膜分别标记为A和B,把消 …… 此处隐藏：7263字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……