荧光定量原理与应用

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实时荧光定量PCR技术与应用

北京元业伯乐科技发展有限公司

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提纲实时荧光定量PCR技术简介： PCR简介 荧光定量PCR技术原理 荧光化学物质简介 多重PCR与内参照基因 定量PCR技术延伸 基因分型(SNP)检测 熔解曲线分析

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PCR概念

什么是PCR?Polymerase Chain Reaction (PCR)聚合酶链反应是在体 外选择性的扩增特定DNA片段的方法。

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PCR 循环

第一步 加热变性、双链打开

第二步 退火、引物与单链结合

第三步 - 引物延伸

变为两个双链DNA

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常规PCR 常规PCR技术： 理论上PCR产物的积累是按照2 指数扩增PCR后借助电泳对扩增反应的终产物进行定量及 定性分析S1 S2 M

n

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常规PCR 常规PCR结合电泳分析方法的局限性 只能对终产物进行分析，无法对起始模板 准确定量 对终产物分析，受PCR过程平台效应的干 扰，定量准确度难以提高(相对误差> 1000%)存在扩增产物的污染问题。 必须在扩增反应结束后借助电泳方法分析， 费时费事而且EB有毒 无法对扩增反应实时检测

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提纲实时荧光定量PCR技术简介： PCR简介 荧光定量PCR技术原理 荧光化学物质简介 多重PCR与内参照基因 定量PCR技术延伸 基因分型(SNP)检测 熔解曲线分析

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定量PCR定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一 个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线实 现对起始模板的定量分析

IQ5 Real-time PCR仪

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定量PCR

● 实时荧光定量PCR三个关键词： ● 实时，荧光，定量 ● 如何实时检测？??

● 借助荧光物质示踪扩增产物量的变化

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PCR反应混合物

荧光物质 Mg Mn2+

Taq DNA多聚酶 或

2+

模板DNA

dCTP dGTP dTTP dATP 引物 缓冲液

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荧光曲线随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号 强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度 信号，得到一条荧光扩增曲线图

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定量原理● 如何对起始模板定量？ ● 通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析 ● 引入两个概念：

● 荧光阈值、Ct值

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定量原理荧光阈值在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度 标准(即PCR扩增产物量的标准)

阈值线

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定量原理 Ct值的概念Ct值的定义是PCR扩增过程中，扩增产物(荧光 信号)到达阈值时所经过的扩增循环次数

C(t) 值

C(t) 值18.12 +/ - 0.04

阈值线