(修改版)琼脂糖电泳检测LDH同工酶

实验九

琼脂糖凝胶电泳分离LDH同工酶

一、实验目的1. 掌握琼脂糖凝胶电泳的原理 及琼脂糖凝胶板的制备； 2. 熟悉琼脂糖凝胶电泳分离LDH同工酶的方法 及组织匀浆的制备、制点样槽、点样、 显色。

二、实验原理带电粒子在直流电场中向所带电荷相反的方 1.电泳：向移动的现象。

能催化功能相同而酶的分子结构、理化 2.同工酶： 性质及免疫学特性不同的一组酶，称为同工酶。

LDH由两种亚基组成的四聚体，即心肌型 H型()和骨骼肌型M型()两种亚基，这两 种亚基以不同的比例组成五种同工酶，结构模 式图如下：

LDH1

LDH2

LDH3

LDH4

LDH5

H亚基为酸性基团，其含量越多，此酶的等电

点越低，与缓冲溶液的pH值之差值就越大，电 泳迁移率就越快。

LDH1>LDH2>LDH3>LDH4>LDH5 根据电泳迁移率的速度不同，可分成五条区带

点样线

LDH5

LDH4

LDH3

LDH2

LDH1

3.显色原理：

LDH活性的区带显紫兰色，颜色的深浅与酶的活性成正比。

三、主要器材及试剂主要仪器

匀浆器

离心机

电泳槽

电泳仪

主要试剂1.PBS缓冲液(pH 7.5) 2.巴比妥缓冲液(pH 8.6) 3. 5g/L、8g/L琼脂糖凝胶 4.显色试剂： (1)D-L-乳酸钠 (2)1g/L吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS) (3)10g/LNAD+ (4)1g/L氯化硝基四氮唑蓝(BNT)

四、操作步骤1.组织匀浆： 取兔子肝、肾、心肌、骨骼肌组织10g于烧杯中， 用PBS缓冲液冲洗2~3次，剪碎匀浆器中，然后加少量 的PBS缓冲液，匀浆研磨，使细胞破碎，LDH释放出 来。 2.离心： 用中号试管装组织匀浆液，4000转/分，离心10分 钟，取上清液1ml于1.5mlEP管。

3.制备琼脂糖凝胶胶板： 取冰箱保存的5g/l的琼脂糖凝胶，置沸水浴 中加热融化，用2ml吸量管取已融化的凝胶 1.8ml~2.0ml,均匀快速地铺盖于洁净的玻片 上。 4.制点样槽：

冷凝后，在凝胶板一端1.2~1.5cm处用小滤 纸片垂直插入，不能触到玻片。

5.点样：

取上清液10μl,垂直均匀点样。 6.电泳：110伏，40分钟，点样端接负极，纱布搭桥， 盖于凝胶玻片两端。

7.显色：

将底物显色液与沸水浴融化的8g/L琼脂糖按4:5的比例混合，制成显色凝胶液，置50℃

热水中备用，注意避光。电泳结束后，加显色凝胶加载凝胶玻片上，

置37℃烤箱中，15分钟。

五、注意事项1. 标本需新鲜，室温保存，PBS液浸泡。 2. 底物显色液须临用前配制，用棕色试剂瓶装， 避光保存于50 ℃水浴箱，复溶后无效。 3. LDH4、LDH5对冷热均敏感，应严格控制温 度，底物显色液如超过50℃,血清标本放置 温度过低，均容易破坏LDH4、LDH5。

六、实验结果乳酸脱氢酶同工酶电泳图谱

七、方法学评价(一)电泳法

琼脂糖凝胶法1. 优点

:灵敏度高，样品取量少，无拖尾现象。 2. 缺点：点样不能过多，否则影响区带效果。 醋酸纤维薄膜法 1.优点:应用普遍、简便、快速、分离清晰

2.缺点：点样量少，LDH4和LDH5易受电热的影响而失活。聚丙烯酰胺凝胶法 1.优点：分辨率高 2.缺点：试剂昂贵，有一定的毒性，操作繁琐

七、方法学评价(二)层析法1.优点：能够准确定量，不受温度的影响。 2.缺点：操作繁琐 (三)免疫化学法 1.优点：操作简便，可以快速测出LDH1和LDH5的 活性。 2.缺点：需要制备抗H 、抗M血清。